20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)是蜜蜂变态发育的重要激素,20E的脉冲式分泌推动了发育阶段的进展。20E与蜕皮激素受体(Ecdysone receptor,ECR)和超气门蛋白(Ultraspiracle,USP)组成的异源二聚体结合形成20E/ECR/USP复合物,该复合物与蜕皮激素反应元件(Ecdysone response elements,ECREs)结合,激活其下游转录因子,启动变态过程。除了20E外,胰岛素(Insulin)是调控昆虫变态发育的另一重要激素。有研究发现20E通过上调胰岛素信号途径的负调控因子FoxO的转录活性并诱导其入核以拮抗胰岛素信号,从而促进昆虫蜕皮和变态并抑制生长。已有研究表明蜜蜂体内20E滴度的周期性变化调控蜜蜂的不同发育阶段和组织形态,核受体ECR和转录因子FoxO参与non-oxidative ethanol biotransformation调控昆虫变态发育。然而,关于20E如何调控意大利蜜蜂幼虫变态化蛹的研究相对较少,其中ECR和FoxO在20E调控工蜂幼虫变态化蛹中的作用机制也尚不清楚。本研究以意大利蜜蜂幼虫为研究对象,通过使蜜蜂幼虫采食添加外源20E的日粮,观察工蜂幼虫采食量、化蛹表型及化蛹时间等,并采用组织形态学、分子生物学和代谢组学等技术,探究20E对工蜂幼虫生长发育、化蛹进程、血淋巴代谢和脂肪体重塑的影响;利用RNA干扰技术,对6日龄(6 d)工蜂幼虫进行ECR和FoxO敲除,采用组织形态学、免疫化学和脂质组学等技术,探究ECR和FoxO敲低对工蜂幼虫化蛹进程、20E信号、血淋巴糖代谢及脂肪体重塑的影响,以期阐明核受体ECR和转录因子FoxO在20E调控工蜂幼虫化蛹中的作用机制,其研究结果如下:1.20-羟基蜕皮酮对工蜂幼虫化蛹及血淋巴糖代谢的影响从意大利蜜蜂蜂群中移取960只1 d工蜂幼虫置于提前放好基础日粮的24孔细胞培养板中,随机分为2组(5个重复/组,96只/重复),一组为对照组,另一组为试验组。将20E溶于无水乙醇,以制备50 mg/m L的20E储备液。用林格氏液将20E稀释至10mg/m L作为20E工作液。对照组饲喂在基础日粮中添加相同剂量无水乙醇的日粮,试验组在基础日粮中添加浓度最终为0.1 mg/m L 20E,饲喂至对照组幼虫达到化蛹体重(160～180 mg),继续STM2457分子量置于培养箱中直到羽化出房,观察并记录各组幼虫的化蛹率和羽化率并采集幼虫样本进行相关指标测定。结果显示:1)饲喂外源20E后,幼虫采食量、化蛹时间、新蜂体重和体长均显著减少(P<0.05),表明20E抑制幼虫采食、缩短幼虫化蛹时间并导致幼虫体型变小。2)饲喂外源20E显著增加幼虫20E滴度以及20E信号关键基因,包括ECR、USP、HR3、E75和Br-c的表达水平(P<0.05)。3)添加外源20E促进幼虫脂肪体细胞解离,显著降低了幼虫脂肪体甘油三酯(Triglyceride,TG)的水平、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl coa carboxylase,ACC)活性(P<0.05),而显著增加了脂肪酶(Lipase)的活性,表明20E促进幼虫脂肪体脂解。4)饲喂外源20E后6 d幼虫脂肪体溶酶体染色、自噬小体数量和大小、AP活性以及ATG5蛋白水平均显著增加(P<0.05),表明20E促进幼虫脂肪体自噬。5)通过血淋巴代谢组学数据分析,筛选出205个差异代谢物,其中D-葡萄糖、UDP-半乳糖和D-(+)-蔗糖的含量均显著上调。KEGG途径富集分析结果显示,这些差异代谢物主要富集在糖酵解/糖异生和半乳糖代谢。6)饲喂外源20E显著增加了幼虫血淋巴中蔗糖、葡萄糖和半乳糖水平(P<0.05),而脂肪体的糖原水平和糖原颗粒的数量却显著降低(P<0.05)。Gs、Hk和Pk的m RNA水平在20E处理后都显著降低(P<0.05),而Pepck、Gp和Pgm的m RNA水平显著升高(P<0.05),表明20E提高幼虫血淋巴葡萄糖水平并调节糖代谢。7)20E处理后6 d和7 d幼虫脂肪体中FoxO蛋白水平和核定位显著增加(P<0.05),而FoxO和Akt的磷酸化水平显著降低(P<0.05),表明20E诱导FoxO转录活性拮抗胰岛素信号。以上结果表明,工蜂幼虫日粮中添加外源20E抑制幼虫采AM-2282半抑制浓度食,缩短幼虫化蛹时间,提高幼虫血淋巴20E滴度和ECR等20E信号途径关键基因的表达,诱导脂肪体自噬和脂解以促进脂肪体重塑,上调FoxO转录活性拮抗胰岛素信号,提高血淋巴葡萄糖水平并影响幼虫体内糖代谢,最终促进工蜂幼虫至蛹的变态并导致蜜蜂体型变小。2.核受体ECR响应20-羟基蜕皮酮促进工蜂幼虫化蛹的分子机制试验选取一批6 d工蜂幼虫,平均分为两组,一组(试验组)注射ds ECR,每只注射10μg,另一组(对照组)注射ds GFP,每只注射10μg。在注射ds RNA 24 h后取样并测定相关指标。另外对RNA干扰后的化蛹表型及化蛹时间进行统计分析。试验结果显示:1)ECR敲低显著增加了工蜂幼虫的化蛹时间(P<0.05),显著降低了幼虫血淋巴20E滴度(P<0.05)。2)与ds GFP+20E组相比,ds ECR+20E组幼虫ECR、USP、HR3、E75、E93和Br-c的表达水平均显著降低(P<0.05)。3)ECR敲低后幼虫血淋巴中葡萄糖水平显著下降,而脂肪体糖原的水平却显著增加(P<0.05)。ECR敲低也显著降低了Pepck、Pgm和Gp的表达水平(P<0.05),而显著增加了Hk、Gs和Pk的表达水平(P<0.05)。4)与注射ds GFP相比,注射ds ECR 24 h后,幼虫体内PI3k、Akt、In R和Ins的m RNA水平显著增加,而FoxO和PTEN的表达水平显著降低(P<0.05)。5)与ds GFP+20E处理的幼虫相比,ds ECR+20E处理的幼虫Caspase-3信号、Caspase-3活性和TUNEL染色均显著降低(P<0.05)。以上结果表明,ECR转录调节与20E生物合成和20E触发的转录级联关键基因的表达来调控工蜂幼虫化蛹进程。ECR上调FoxO和PTEN的表达水平抑制胰岛素信号,提高幼虫血淋巴葡萄糖水平。ECR介导20E上调凋亡基因表达,诱导脂肪体细胞凋亡,从而加速工蜂幼虫化蛹过程中脂肪体重塑。3.FoxO在20-羟基蜕皮酮促进工蜂幼虫化蛹中的功能解析选取一批6 d工蜂幼虫,平均分为两组,一组(对照组)注射ds GFP,每只注射10μg。另一组(试验组)注射ds FoxO,每只注射10μg。在注射ds RNA 24 h后取样以进行后续相关指标的测定。另外对RNA干扰后的幼虫化蛹表型及化蛹时间进行统计分析。试验结果显示:1)FoxO敲低的幼虫出现延迟化蛹的现象,其体内20E滴度和20E信号途径关键基因的转录水平,包括ECR、E74、E75、E93和Br-c,均显著降低(P<0.05)。2)注射ds FoxO的幼虫脂肪体中脂滴的大小和数量、TG的含量、FAS和ACC活性均显著增加,而Lipase活性显著降低(P<0.05)。3)注射3-MA后幼虫溶酶体染色、自噬小体数量和大小、AP的活性以及LC3-II的表达均显著降低(P<0.05)。4)注射3-MA的幼虫脂肪体中脂滴的大小和数量以及TG含量均显著增加(P<0.05),而lipase-1,lipase-2和akhr表达水平均显著降低(P<0.05)。5)FoxO敲低的幼虫脂肪体溶酶体染色、自噬小体数量和大小、AP活性以及ATG5蛋白水平均显著降低(P<0.05)。以上结果表明,FoxO通过调控20E生物合成和20E信号途径关键基因的表达参与20E诱导的变态化蛹过程。FoxO诱导脂肪体自噬和脂解,从而促进工蜂幼虫变态化蛹过程中的脂肪体重塑。综上所述,20E在工蜂幼虫至蛹的转变过程中发挥重要作用;添加外源20E抑制工蜂幼虫采食,缩短幼虫化蛹时间,影响幼虫血淋巴代谢平衡,从而加速工蜂幼虫至蛹的变态过程并导致蜜蜂体型变小;20E通过ECR上调FoxO转录活性拮抗胰岛素信号,提高幼虫血淋巴葡萄糖水平并促进脂肪体重塑,最终促进工蜂幼虫至蛹的变态。