研究背景糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)作为糖尿病最常见的心血管并发症之一,是指不伴随高血压和冠状动脉等心血管疾病下心脏的结构和功能受到损伤。临床上主要表现为心脏扩大、心肌舒张及收缩功能下降,是糖尿病患者心衰及猝死的重要原因。研究表明,(前)肾素受体[(pro)renin receptor,PRR]是肾素的特异性受体,作为RAS系统的重要组分,是糖尿病发病及其导致终末器官损害的关键因素。焦亡,作为一种伴随炎症级联反应的新型细胞死亡方式,也参与DCM病理过程。此外,Netosis,中性粒细胞抵御外界刺激的形式,可由焦亡炎症分子激活,依旧参与了 DCM病理过程。但关于DCM的现有研究中,尚未有研究探讨PRR是否参与DCM中心肌细胞焦亡以及PRR是否通过影响Netosis的产生及调控焦亡-Netosis环路影响DCM心肌细胞焦亡,故探讨PRR对DCM心肌细胞焦亡的影响及其机制,可能对于治疗DCM提供新的靶点和思路。研究目的1.通过构建糖尿病心肌病大鼠模型,观察DCM心肌组织中PRR、caspase-1NSC 125973作用、IL-1β、IL-18等焦亡相关分子的表达情况;2.通过构建过表达PRR的腺病毒载体,观察PRR过表达对DCM心肌组织中caspase-1、IL-1β、IL-18等焦亡相关分子表达水平、DCM心功能的影响;3.通过提取原代心肌细胞,构建过表达PRR的腺病毒载体,观察原代心肌细胞中PRR与caspase-1、IL-1β、IL-18等焦亡相关分子的表达情况,并收集细胞上清液刺激中性粒细胞,观察PRR过表达对高糖刺激下的中性粒细胞NETs的影响。接着阻断焦亡通路,观察PRR过表达对NETs形成的影响;4.通过中性粒细胞强刺激剂PMA刺激中性粒细胞产生NETs,提取NETs与原代心肌细胞孵育,观察NETs对心肌细胞焦亡的影响。研究方法1.PRR过表达腺病毒载体构建:于Genbank基因库中查询大鼠PRR基因序列(Gene ID:302526),并授权上海吉玛公司构建PRR基因过表达载体[由腺病毒(adenovirus)包被],同时构建空病毒载体Ad-EGFP作为基因过表达的对照。2.DCM大鼠模型构建:适应性喂养60只8周龄的Wistar大鼠。一周后,随机分为4组:对照组、DCM组、Ad-EGFP组、Ad-PRR组,其中DCM组、Ad-EGFP 组、Ad-PRR 组禁食 过夜后,于腹腔内注射高剂 量链脲佐菌素(STZ)(60mg/kg)。1周后,若测得血糖>11.1mmolCaptisol生产商/L,且伴有多饮、多尿、多食等典型糖尿病症状,则判定为糖尿病模型造模成功。继续喂养12周后,行超声检查各组大鼠心功能,当出现心腔扩大,且伴有收缩功能减弱则视为DCM造模成功。随后,DCM组、Ad-EGFP组、Ad-PRR组分别经尾静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS)、Ad-EGFP(1 × 109fu/100μL,PBS 溶解)、Ad-PRR(1 × 109fu/100μL,PBS溶解)。病毒注射2周后,每组随机选取大鼠数量的一半检测病毒转染效率。病毒注射4周后,将各组大鼠麻醉后行超声检测心功能,并取材以备后续实验。3.分别于造模前、后测量大鼠体重、血糖。4.心功能检测:慢病毒注射4周后使用VEVO770成像系统检测各组大鼠心功能。检测前使用3%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉大鼠,并剔除毛发以暴露胸部。5.采用免疫组织化学染色法观察心肌组织中PRR、TGF-β、胶原Ⅰ,胶原Ⅲ等纤维化蛋白的表达量。6.采用HE染色法观察心肌组织结构变化。7.采用免疫组织化学染色法观察心肌组织中caspase-1、IL-1β、IL-18等焦亡蛋白的表达量。8.原代心肌细胞提取:取0～3日龄乳鼠心脏,并用预冷的PBS冲洗,剪碎,两步法消化后,过滤留取上清液,以1000rpm、25℃离心10 min。使用差速贴壁法留取较纯的心肌细胞,再用心肌细胞培养液悬浮。悬浮后接种至六孔板。9.原代心肌细胞干预:将原代心肌细胞分为正常组、高糖组、AD-EGFP组、AD-PRR组,其中,Ad-PRR组及Ad-EGFP组在分别转染Ad-PRR、Ad-EGFP后,同高糖组一起给予高糖刺激,观察PRR过表达对caspase-1、IL-1β、IL-18等焦亡相关蛋白的影响。10.应用免疫印迹法(Western blot)检测心肌组织及心肌细胞中PRR、caspase-1、IL-1β、IL-18等分子的蛋白表达水平。11.中性粒细胞提取:提取大鼠外周新鲜抗凝全血,分别加入试剂A,B,离心机4℃ 700g离心30min。离心结束后可见试管中出现明显的双层白色细胞层,其中上层细胞为单核细胞层,下层细胞为中性粒细胞层。用吸管小心吸取中性粒细胞层于离心管中,清洗再离心以纯化。12.NETs激发:应用PMA刺激中性粒细胞激发NETs,并提取纯化NETs刺激原代心肌细胞,检测其焦亡相关蛋白的表达。13.应用ocular infection酶联免疫吸附实验(ELISA)检测心肌细胞培养上清液中IL-1β、IL-18的含量。14.统计学分析:使用GraphPad 9.0软件处理各组数据,用平均数±标准差表示各组实验数据,采用单因素方差分析法分析多组数据间的相互比较。其中,P<0.05判定为差异有统计学意义。研究结果1.在DCM大鼠心肌组织中PRR表达水平升高,焦亡相关蛋白caspase-1、IL-1β、IL-18等表达水平增加。2.过表达PRR可明显增加DCM大鼠心肌组织中胶原纤维沉积,恶化DCM心功能。3.原代心肌细胞过表达PRR可以促进中性粒细胞NETs的产生,使用焦亡封闭受体孵育心肌细胞发现中性粒细胞NETs产生减少。4.NETs可加重PRR过表达基础上的心肌细胞焦亡程度,加重糖尿病心肌病心肌病变。结论及意义在DCM模型中,高血糖可刺激PRR表达升高并伴随DCM焦亡、心肌纤维化等水平升高。过表达PRR明显增加DCM心肌组织中焦亡水平及心肌纤维化水平,进而加重DCM心功能损伤。同时心肌细胞PRR过表达可刺激中性粒细胞NETs产生,反之NETs又加重心肌细胞焦亡,且阻断焦亡通路中性粒细胞NETs产生减少,这表明PRR通过调控焦亡-NETs环路参与了 DCM心肌焦亡,加重糖尿病心肌病心肌损伤。这可能为DCM的治疗提供新思路和靶点。