龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是重要的亚热带经济果树。龙眼体胚发生系统是木本植物体胚发生的优良模式系统。快速碱化因子(RALF)家族广泛分布于植物Taurine配制与真菌中,是对植物的细胞扩张、根系生长、有性生殖和应对胁迫等都具有影响的一类植物短肽激素。现有研究证明RALF肽在植物的生殖生长中具有重要调控作用。研究龙眼RALF基因家族在体胚发生早期的表达模式和功能可以为植物胚胎发育过程中的分子调控机制提供具有价值的参考依据。因此,本研究基于龙眼基因组数据库对RALF基因家族进行全基因组鉴定、生物信息学分析与表达模式分析;验证候选基因Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9的序Initial gut microbiota列,并构建p CAMBIA1301过表达载体,通过稳定遗传转化龙眼胚性愈伤组织对龙眼体胚发生早期Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9的生物学功能进行初步探究;验证了Dl RALF基因家族拮抗芸苔素内酯调控龙眼早期体胚发生。主要研究结果如下:1龙眼RALF家族全基因组鉴定及生物信息学分析Dl RALF基因家族具有10个成员,本物种内存在4对具有共线性关系的成员,与无患子科其他植物之间也存在较强的共线性关系;亚细胞定位预测均定位在胞外;Dl RALF家族基因成员启动子中含有大量的光响应元件、逆境胁迫响应元件、组织特异性生长元件和激素响应元件。本研究结果表明,Dl RALF基因家族成员高度保守,进化方式与其他无患子科植物类似,且具有功能多样性。2龙眼RALF基因家族的表达模式分析通过对Dl RALF基因家族的表达模式进行分析发现,Dl RALF基因家族成员在体胚发生不同阶段表达模式差异较大,且响应5-氮胞苷、温度、干旱、光质和Dl MIR408-OE等多种处理。基于对Dl RALF基因家族成员的生物信息学与表达模式分析,选定具有完整保守基序、响应多种处理且可能参与调控龙眼体胚发生的成员Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9作为候选基因。候选基因Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9以不同模式响应生长素、脱落酸与茉莉酸甲酯的调控。推测Dl RALF基因家族响应包括生长素和脱落酸在内的多种处理,并参与调控龙眼体胚发生及各器官生长发育。3龙眼RALF家族在胚性愈伤组织中的遗传转化研究及转录水平的调控研究为进一步探究Dl RALFs在龙眼体胚发生早期的功能,将携带关键成员序列的p CAMBIA1301过表达载体稳定遗传转化龙眼胚性愈伤组织,获得Dl RALF4-OE、Dl RALF5-OE、Dl RALF9-OE和Dl MIR408-OE龙眼胚性培养物细胞系材料并探究Dl RALFs/Dl MIR408潜在的基因互作调控网络。结果显示:Dl MIR408上调Dl RALF4和Dl RALF5的表达,而显著下调了Dl RALF9的表达;Dl RALF4与Dl RALF9下调dlo-mi R408-3p的表达;Dl RALF4、Dl RALF9和Dl MIR408调控Dl YUC家族成员Dl YUC4与Dl YUC8以及糖基化磷脂酰肌醇通路上成员Dl GPI8与Dl FER的表达;Dl RALF5对上述成员的表达量影响均不显著。推测Dl RALF4、Dl RALF9与Dl MIR408共同构建基因互作调控网络并参与生长素合成代谢和糖基化磷脂酰肌醇途径等通路,Dl RALF基因家族成员可能通过这一通路参与龙眼体胚发生中的生长与形态建成。4龙眼体胚发生早期Dl RALF4-OE、Dl RALF5-OE和Dl RALF9-OE细胞系的生理生化功能研究对Dl RALF4-OE、Dl RALF5-OE和Dl RALF9-OE龙眼胚性培养物细胞系中生理生化指标进行测定,比较分析发现:Dl RALF4-OE、Dl RALF5-OE和Dl RALF9-OE细胞系均具有碱化胞外介质这一典型功能;与空载(Empty vector,EV)相比,Dl RALF4-OE与Dl RALF9-OE细胞系中内源IAA含量上升,Dl RALF5-OE和Dl RALF9-OE细胞系中内源ABA含量下降,这3个基因都具有降低内源BR含量的作用,说明Dl RALF基因家族在龙眼胚性培养物中具有调控内源激素IAA、ABA和BR含量的作用;Dl RALF4-OE、Dl RALF5-OE和Dl RALF9-OE细胞系中SOD和POD的活性与类黄酮含量均较EV显著上升,Dl RALF4和Dl RALF5显著提升了羟自由基清除率,但Dl RALF9降低了羟自由基清除率,这3个候选基因均显著提高了龙眼体胚发生早期的总抗氧化能力。因此,推测Dl RALF基因家族通过提高抗氧化物的含量和抗氧化物的活性增强了龙眼胚性培养物的抗氧化能力,保证胚性细胞氧化还原环境平衡,并起到维持龙眼愈伤组织胚性和抵抗胁迫的作用。5 Dl RALFs响应外源芸苔素内酯并参与调控龙眼体胚早期发生芸苔素内酯与RALF肽在调控根系生长上具有拮抗关系,且芸苔素内酯在棉花等多个物种中具有调控体胚发生的作用。因此,通过芸苔素内酯处理龙眼胚性愈伤组织,进一步探究Dl RALF基因家族与芸苔素内酯的互作关系及其在龙眼体胚发生早期的功能。结果显示,基于球形胚(GE)诱导培养基和添加高浓度生长素类似物2,4-D的继代培养基下添加外源芸苔素内酯促进龙眼体胚早期发生,抑制龙眼胚性培养物的增殖,其中0.5 mg/L浓度芸苔素内酯处理的差异最为显著;芸苔素内酯对IAA和ABA的含量均具有抑制作用,而芸苔素内酯和2,4-D在调控内源激素含量上可能具有拮抗作用;Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9受到芸苔素内酯和2,4-D的调控,但在不同浓度、不同天数和不同组合方式的芸苔素内酯处理中的表达模式不同;Dl RALF4、Dl RALF5和Dl RALF9均下调芸苔素内酯合成基因Dl CYP92C6的表达MCC950分子量。综上所述,Dl RALF基因家族关键成员具有拮抗芸苔素内酯的作用,而芸苔素内酯促进龙眼体胚早期发生,抑制龙眼胚性培养物的增殖,这可能是芸苔素内酯与其他激素例如IAA、ABA和RALF肽激素互作而调控的。综上所述,Dl RALF基因家族与Dl MIR408相互作用于激素串扰网络和糖基化磷脂酰肌醇通路,并通过与IAA、ABA和BR等植物激素互作参与龙眼体胚发生的过程;此外,Dl RALF基因家族关键成员通过调控抗氧化物的含量与活性,起到调控龙眼胚性培养物氧化环境稳态和抵抗逆境胁迫的作用。