红枣(Ziziphus jujuba Mill.)作为一种药食同源产品,具有较高的营养和药用价值。多糖是其发挥功效的重要活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗癌及保护肝脏等多种生物活性。黑枣是由红枣在固态发酵下获得的一种产品,具有更高的营养价值和加工利用前景。目前关于红枣多糖治疗结肠炎的相关研究已经被报道,但黑枣多糖对结肠炎的保护作用及机制研究鲜有报道。本研究利用分离纯化技术得到了一种黑枣多糖(BJP-4),对其结构进行了表征,并通过构建细胞炎症模型和小鼠结肠炎模型分析了BJP-4的抗炎活性。具体研究结果如下:(1)黑枣多糖的分离纯化采用超声波辅助热水提取法得到粗多糖,再经过脱脂、除蛋白、醇沉、DEAE-52纤维素离子交换柱、Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱及冷冻干燥等处理方法后得到一个纯化组分,并命名为BJP-4。BJP-4的总糖含量为95%±0.72%,紫外光谱(Ultraviolet,UV)显示它含有极少的核酸和蛋白质。(2)BJP-4的结构表征通过高效凝胶渗透色谱(High-performance gel permeation chromatography,HPGPC)和高效阴离子交换色谱(High-performance anion-exchange chromatography,HPAEC)法分别测定了BJP-4的分子量(Weight-average moleculaGW-572016体外r weight,Mw)大小和单糖组成,结果显示:BJP-4主要由半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖组成,质量比为49.40:33.54:7.71:7.19,Mw为1.24×10~5Da。综合红外光谱(Fourier transform infrared spectrum,FT-IR)、核磁(NAMP-mediated protein kinaseuclear magnetic resonance,NMR)及甲基化的检测结果,表明BJP-4以→4)-α-L-Galp A(1→,→5)-α-L-Araf(1→和→4)-β-D-Galp(1→为主,同时具有α和β型的糖苷键。高级结构分析结果显示,BJP-4在原子力电镜(Atomic force microscopy,AFM)下为球状肿块状,呈现分子聚集效应,在X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)下兼具晶体和非晶体结构,在圆二色谱(Circular dichroism spectrum,CD)下表现出不具有三螺旋结构。(3)BJP-4的体外抗炎活性通过建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症模型,分析了BJP-4的抗炎能力。结果表明,BJP-4的作用机制可能为通过抑制Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核转录因子kappa-B(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路的激活,调节细胞因子的释放,调控相关酶的活性,进而减轻细胞炎症。具体表现为:抑制NO的分泌,降低肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin,IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的含量和m RNA表达量,同时减少诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)和环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)相关m RNA和蛋白的表达水平。(4)BJP-4的体内抗炎活性通过构建葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导的溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)小鼠模型,发现BJP-4具有一定的体内抗炎活性,且通过介导TLR4/髓样分化Blebbistatin体内实验剂量因子(Myeloid differentiation factor 88,My D88)/NF-κB/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)信号通路,维持炎症细胞因子的平衡,抑制氧化应激,保护肠屏障的完整性,恢复肠道微生物群的丰富度和组成,增加短链脂肪酸SCFAs(Short chain fatty acids,SCFAs)产生,进而对结肠炎起到缓解作用。实验期间观察发现,与模型组相比,BJP-4干预可以显著减缓体重下降,升高胸腺指数,降低脾指数,减少DAI评分,抑制结肠缩短。H&E染色结果显示,BJP-4能够修复上皮屏障损伤,阻止炎性细胞的浸润。BJP-4还可以调节氧化状态,增加超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)的活性,减少丙二醛(Malonydialdehyde,MDA)的生成量。通过RT-PCR技术检测发现BJP-4能提高带状闭合蛋白-1(Zona occludens-1,ZO-1)和黏蛋白-2(Mucin-2,Muc-2)的m RNA表达水平。Western Blot分析表明,BJP-4可显著上调TLR4、My D88、NLRP3和凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)的水平以及降低p-NF-κB/NF-κB比率。通过气相色谱法-质谱法联用(Gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)法测定发现BJP-4可以增加SCFAs的含量,如乙酸、丙酸和丁酸。16S r RNA基因测序结果显示BJP-4能够增加结肠炎小鼠肠道菌群的α和β多样性,同时在门和属水平上调节肠道微生物的组成,增加有益菌数量,降低有害菌的丰度。