目的:本课题主要从体内动物水平探讨黄芩苷对对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)肝毒性的解毒修复作用,并深入研究其促进APAP肝损伤的修复作用机制,从而为黄芩苷保肝作用的进一步发掘提供实验依据。方法:1.评价黄芩苷对APAP诱导的肝损伤的作用GW4869作用:小鼠采用300 mg/kg APAP腹腔注射染毒,建立动物损伤模型。通过赖氏法检测血清谷丙/谷草转氨酶(ALT/AST)水平,通过H&E染色法观察肝脏的病理变化。2.评价黄芩苷对APAP肝损伤后肝细胞的增殖作用:采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测小鼠肝脏肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)和表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)m RNA的表达;通过Beyo Click~(TM)Ed U法检测细胞增biomarkers of aging殖情况;通过免疫组化染色法观察增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)阳性细胞数量;通过Western-blot法检测小鼠肝脏中PCNA和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)蛋白的表达。3.揭示黄芩苷激活m-TOR信号通路作用:通过Western-blot法检测小鼠肝脏中p62、LC-3B、p-m TOR和p-S6蛋白表达。4.验证m-TOR信号通路在黄芩苷促进APAP肝损伤的修复中的关键作用:通过Western-blot法,结合应用m-TOR抑制剂雷帕霉素,检测小鼠肝脏中p62、LC-3B、p-m TOR、p-S6、PCNA和CyclDocetaxel细胞培养in D1蛋白表达检测;通过赖氏法检测血清谷丙/谷草转氨酶(ALT/AST)水平;通过H&E染色法观察肝脏的病理变化;通过Beyo Click~(TM)Ed U法检测细胞增殖情况;通过免疫组化染色法观察PCNA阳性细胞数量。结果:1.在APAP诱导的C57BL/6小鼠急性肝损伤模型上,黄芩苷治疗给药有显著的保肝作用:小鼠腹腔注射APAP(300 mg/kg)1小时后灌胃黄芩苷(40,80 mg/kg),能明显降低APAP诱导升高的ALT和AST酶活性水平(p<0.05);观察肝脏H&E染色发现,黄芩苷(40,80 mg/kg)能明显改善APAP诱导的大范围肝出血以及坏死的肝细胞;将损伤面积量化后,发现黄芩苷(40,80 mg/kg)能显著减少APAP诱导的肝坏死面积(p<0.01,p<0.05)。2.通过观察肝组织病理切片中肝细胞有丝分裂数量发现,黄芩苷(40,80 mg/kg)能显著增加肝细胞有丝分裂数量(p<0.05)。EDU细胞增殖结果显示黄芩苷(40,80mg/kg)能显著增强EDU荧光强度(p<0.05)。黄芩苷可以增加APAP降低的HGF和EGF m RNA的表达。同时PCNA免疫组化染色切片显示,黄芩苷(40,80 mg/kg)能显著增加PCNA阳性细胞数(p<0.05)。蛋白电泳实验发现黄芩苷可以显著增加APAP降低的PCNA和Cyclin D1蛋白的表达。3.在m-TOR信号通路的研究中,发现黄芩苷可以降低APAP增加的LC-3B蛋白的表达,增加APAP降低的p62、p-m TOR和p-S6蛋白的表达。4.应用m-TOR抑制剂雷帕霉素后,黄芩苷激活m-TOR信号通路的作用被抑制,使得黄芩苷降低ALT、AST酶活性和减轻肝脏病理损伤的作用被取消(p<0.05);应用m-TOR抑制剂雷帕霉素后,黄芩苷增加肝细胞有丝分裂数和肝切片EDU荧光强度、增加的PCNA阳性细胞数(p<0.05)的作用也被削弱。蛋白电泳实验发现雷帕霉素明显降低了黄芩苷增加的小鼠肝脏PCNA和Cyclin D1蛋白的表达。结论:黄芩苷能减轻APAP诱导的肝损伤,并促进肝细胞的增殖,增加EGF、HGF和PCNA、Cyclin D1的表达从而加快肝脏的修复,但这些作用可以被雷帕霉素所抑制。由此我们猜测,黄芩苷促进肝修复的作用机理与其激活m-TOR信号通路的促细胞增殖,并抑制其介导的自噬密切相关。