鹅具有耐粗饲,适应力强,肉质鲜嫩营养丰富的特点,广受养殖户和消费者的欢迎。但由于鹅产蛋量低严重阻碍了我国鹅产业的发展与壮大。因此提高鹅产蛋量已成为目前养鹅业中迫切需要解决的问题之一。产蛋性能的高低主要由卵泡发育与选择的结果决定,家禽卵泡发育严格遵循等级发育体系,研究表明,大量卵泡颗粒细胞(Granulosa cells,GCs)的程序性死亡是引起卵泡发生闭锁进而不能进入等级阶段的关键因素。因此探讨鹅卵泡发育与选择过程中GCs程序性死亡的调控机制对于提高鹅产蛋量至关重要。卵泡液中包含丰富的生物活性物质(脂质、miRNA、mRNA和蛋白质),这些生物活性物质是否影响GCs增殖或程序性死亡过程?有研究表明,卵泡液中某些活性物质可通过外泌体载体作用于GCs,从而影响卵泡发育和卵泡闭锁的进程。鹅作为产蛋量低的家禽,其卵泡发育是否也受卵泡液外泌体介导的某些活性物质对GCs程序性死亡过程发挥作用,从而导致卵泡大量闭锁,目前尚不清楚。鉴于此,本研究以产蛋高峰期的扬州鹅为研究对象,探究鹅闭锁小黄卵泡(atretic small yellow follicle,ASYF)与正常小黄卵泡(small yellow follicle,SYF)中卵泡液外泌体蛋白组分差异及其对GCs程序性死亡的调控作用机制。研究旨在揭示闭锁卵泡液外泌体对GCs程序性死亡的调控作用,结果不仅有助于揭示鹅卵泡闭锁发生的生理机制,还可为提高鹅的产蛋性能提供理论参考。1.鹅SYF与ASYF组织形态、颗粒层细胞程序性死亡标志物、性类固醇及抗氧化水平检测为了解鹅SYF与ASYF组织形态与生理差异,采用HE染色、透射电子显微镜观察、免疫组化和RT-qPCR等方法对产蛋高峰期SYF与ASYF的组织形态、颗粒层细胞程序性死亡标志物、性类固醇合成能力及抗氧化水平进行了检测。结果显示:产蛋高峰期在鹅卵泡的等级发育过程中,大量SYF发生闭锁,极大减少了进入等级卵泡池的SYF数量。与SYF相比,ASYF的颗粒层细胞间连接松散,向内脱落;ASYF凋亡小体和自噬小体数增多,线粒体发生皱缩,线粒体嵴消失;ASYF中凋亡相关基因Caspase3、Caspase8、Caspase9和BAX和自噬相关基因Atg12、Atg5、Beclin1和LC3的mRNA表达量显著高于SYF(P<0.05)。铁死亡相关基因GPX4的mRNA表达量显著低于SYF(P<0.05),COX2、HMOX1和 PROM2 的 mRNA 表达量显著高于 SYF(P<0.05),NCOA4和TXNIP的mRNA表达量极显著高于SYF(P<0.05),WB检测显示ASYF中GPX4表达量显著低于SYF(P<0.05)。类固醇相关指标检测显示ASYF中E2和P4含量以及性类固醇合成相关基因CYP19A、HSD1 7B的mRNA表达量显著低于SYF(P<0.05)。ASYF中ROS及H2O2和MDA的含量显著高于SYF(P<0.05),T-AOC、SOD和GSH活性显著低于SYF(P<0.05)。上述结果表明,鹅卵泡闭锁时大量GCs发生程序性死亡,颗粒层脱落,性类固醇和抗氧化水平显著降低。2.鹅SYF与ASYF卵泡液外泌体差异蛋白组学分析为探明鹅卵泡液外泌体在鹅卵泡发育和卵泡闭锁过程中的重要作用,本研究利用TMT标记技术对提取并鉴定的SYF与ASYF卵泡液外泌体筛选差异表达蛋白质,结果显示,外PR-171泌体中可携带蛋白质种类高达4000多种,与SYF相比,ASYF外泌体中携带的差异蛋白质有1615种,其中上调蛋白905种,下调蛋白710种。GO功能分析显示差异蛋白主要与细胞表面受体信号通路、细胞粘附、生物粘附等细胞通讯功能相关。KEGG分析显示主要富集的细胞功能包括细胞生长与程序性死亡和细胞活性等。PPI网络分析发现富集在铁死亡通路上的HMOX1位于网络调控节点中心且仅在ASYF卵泡液外泌体中大量表达。采用Western blot对SYF与ASYF卵泡液外泌体中HMOX1进行了定量验证,发现其表达情况与蛋白组测序结果一致。该结果筛选出了鹅SYF与ASYF卵泡液外泌体差异表达蛋白,为进一步研究关键差异蛋白HMOX1在GCs程序性死亡导致的卵泡闭锁中作用机制奠定了基础。3.鹅卵泡液外泌体蛋白HMOX1调控GCs铁死亡分子机制为验证外泌体蛋白HMOX1在调控GCs程序性死亡中的作用,本研究AZD1152-HQPA供应商将提取并鉴定的鹅SYF与ASYF卵泡液外泌体分别加Ready biodegradation入体外分离的鹅GCs,结果显示,卵泡液外泌体可以通过胞吞作用进入GCs内。与SYF相比,ASYF卵泡液外泌体显著降低GCs细胞活性(P<0.05),显著升高GCs的MDA和亚铁离子水平(P<0.05),显著降低GCs线粒体膜电位(P<0.05),且以上变化可以被铁离子螯合剂DFO逆转(P<0.05)。研究表明ASYF卵泡液外泌体会诱导GCs铁死亡。为了进一步检测GCs铁死亡发生是否与ASYF卵泡液外泌体HMOX1大量表达有关,进一步构建过表达HMOX1重组质粒转染GCs和添加HMOX1特异性抑制剂Znpp,分析外泌体差异蛋白HMOX1对GCs的影响。结果显示HMOX1过表达后,GCs细胞活性显著降低(P<0.05),亚铁离子含量显著升高(P<0.05),GPX4蛋白质表达量降低(P<0.05),MDA水平升高(P<0.05)。添加抑制剂Znpp显著缓解了由HMOX1升高引起的细胞活性降低,亚铁离子升高和MDA水平升高(P<0.05)。上述结果提示,外泌体蛋白HMOX1可介导铁死亡通路调控GCs程序性死亡参与卵泡闭锁。综上,鹅卵泡发育与选择中,闭锁小黄卵泡颗粒层脱落,大量的GCs发生程序性死亡。卵泡液外泌体可以通过胞吞作用进入GCs,并通过运输过载的HMOX1介导铁死亡通路诱导GCs程序性死亡参与卵泡闭锁的调控。