巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibiFerrostatin-1说明书ting factor,MIF)是一种促炎细胞因子,作为一种高度保守的分泌性蛋白,在炎症和免疫反应、肿瘤的发生发展等一些生物学过程中具有重要作用。CD74又称为恒定链(Ii),是MIF的受体,MIF通过与CD74的细胞外结构域结合,使PI3K-Akt信号转导级联、NF-κB和AMP活化蛋白激酶(AMPK)通路以及细胞外信号调节激酶(ERK)通路激活。本研究将鸡CD74基因通过跨膜区及信号肽序列分析后,截取其第62-175位氨基酸作为目的片段,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切将其克隆至pET-28a载体上,构建出重组质粒pET-28a-CD74(62-175 aa),并将重组质粒pET-28a-CD74(62-175 aa)和本实验室构建的pET-11b-MIF分别转化E.coli BL21(DE3),进行MIF和CD74重组蛋白的诱导表达,获得的重组蛋白进行镍柱亲和层析纯化后,SDS-PAGE和Western blot鉴定,结果表明成功获得鸡重组MIF和CD74蛋白。获得的重组蛋白分别进行小鼠皮下多次注射免疫,免疫三次后,按照建立的间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbeVX-765nt assay,ELISA)方法进行效价的测定,选取免疫MIF蛋白后效价达到1:51200的一只小鼠进行脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)的融合,融合后的杂交瘤细胞采用间接免疫荧光(immunofluorescenceassay,IFA)和间接ELISA两种方法进行筛选,阳性的细胞株运用有限稀释法进行三次亚克隆,获得了3株能稳定分泌抗鸡MIF蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2G11、2E7、4Chronic bioassayE8,将2E7细胞株注射到提前用液体石蜡致敏的经产母鼠腹腔中制得腹水,测定效价为1:64000。免疫CD74重组蛋白的小鼠效价达到1:25600后摘眼球采血,离心后的血清即为抗鸡CD74的多克隆抗体,将CD74(62-175 aa)通过Xho Ⅰ和BamH Ⅰ克隆至慢病毒载体pLVX-AcGFP-N1 中,构建重组表达质粒 pLVX-AcGFP-N1-CD74(62-175 aa),并将重组质粒转染生长状态良好的293T细胞中,制样后分别以IFA和Western blot试验进行抗鸡CD74多克隆抗体的反应性鉴定,结果表明制备的抗鸡CD74多克隆抗体反应性良好。对3株抗MIF单克隆抗体进行抗原表位的鉴定,采用交互重叠多肽法将MIF全长截短为X1(MIF 1-80 aa)、X2(MIF 63-115 aa)、Y1(MIF 1-37aa)、Y2(MIF 37-76 aa)、Y3(MIF 13-76aa)、Y4(MIF 17-76 aa)6个片段,结果表明3株单克隆抗体细胞株针对相同的抗原表位,即13DAVPD17。采用本实验室已制备的另一株针对MIF不同抗原表位的单克隆抗体1F6和2E7的腹水共同建立MIF双抗体夹心ELISA检测方法,已知1F6和2E7分别针对重组MIF蛋白不同的抗原表位,将腹水采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后进行HRP标记,当1F6作为捕获抗体,2E7作为检测抗体,反应参数分别为包被方式4℃12 h,封闭液选择5%脱脂奶封闭2 h,重组MIF蛋白37℃孵育1 h,检测抗体2E7-HRP37℃孵育1 h,显色时间为37℃,15 min时,建立的检测方法检测效果较好,并测得该方法检测的线性范围为 0.039-5 μg/mL,Y=0.7062X+0.1252,R2=0.9954,检测极限值为 0.021 μg/mL,进行该方法的重复性测定,无论是批次内重复性测定还是批次间重复性测定,其变异系数(CV)均小于10%,表明建立的方法重复性良好。