研究背景骨性关节炎(OA)—种慢性关节疾病,最终可导致关节功能丧失。近年来OA的发病率不断上升,其致畸致残率高,已成为国内外重大的公共健康问题,但是目前尚没有治愈或阻止其进展的有效手段。因此,探讨并阐明OA的发病机制、危险因素,是目前基础、临床研究亟待解决的问题。最新观点认为OA与“代谢紊乱”、“炎性衰老”等多种代谢因素相关,是一种代谢性疾病。临床研究证实,高脂饮食带来的高甘油三酯血症与OA的发生发展密切相关。高甘油三酯血症引起的游离脂肪酸(FFAs)升高,可对机体组织细胞产生脂毒性。脂毒性与多种代谢相关疾病的发病相关,也是OA发病机制中的一个重要因素,但其确切机制目前尚不清楚。内质网应激(ERS)激活导致的细胞凋亡与许多疾病的发病机制有关。ERS主要涉及三条通路:IRE1通路、ATF6通路和PERK通路。基础研究证实,ERS与OA的发病相关,但高脂饮食产生的脂毒性是否通过ERS引发软骨细胞凋亡,及其在OA发生发展中的确切机制,目前尚不明确。本研究采用体内(建立高脂饮食OA模型)和体外[棕榈酸(PA)处理关节软骨细胞]相结合的方法,探究高脂饮食对OA的影响,以及ERS在高脂饮食相关OA的作用及相关机制,为临床研究高脂饮食相关OA提供理论依据。我们的假设是selleckchem,高脂饮食通过激活ERS引起软骨细胞凋亡从而促进高脂饮食相关OA的发生发展。研究方法建模方法:体内实验:PUN30119试剂经山东省立医院动物伦理委员会批准后,6～7周龄雄性SD大鼠随机分为对照组(CON组,普通饮食)、15%高脂饮食组(15%HFD组,定制饮食)和25%高脂饮食组(25%HFD组,定制饮食)。后2组大鼠的饮食中含有不同浓度的猪油,分别为15%和25%,可诱发高甘油三酯血症。本研究又通过对3组大鼠行内侧半月板切除术(DMM),建立大鼠高脂饮食OA模型。体外实验:应用不同浓度的PA处理大鼠原代关节软骨细胞,PA可有效地对软骨细胞产生脂毒性。我们使用特异性抑制剂在体外和体内分别抑制3条ERS相关通路,包括IRE1通路、ATF6通路和PERK通路,以验证上述3条通路在高脂饮食相关OA中的作用。OA导致疼痛行为学检测:机械痛阈测试缩爪阈值(MWT)。膝关节退变/炎症恢复情况检测:苏木素-伊红(H&E)染色和国际骨关节炎研究学会(OARSI)评分、番红-固绿(S-O)染色和软骨损伤分级(Mankin)评分。基质金属蛋白酶(MMPs)及COL2A1mRNA和蛋白表达水平检测:实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫印迹实验。ERS标志物蛋白表达水平检测:免疫印迹实验。凋亡检测:免疫印迹实验、TUNEL染色和流式细胞术。研究结果高脂饮食加重OA对关节软骨的破坏:与CON组相比,15%HFD组大鼠OA膝关节软骨的破坏程度显著增高,差异具有统计学意义(p<0.05);与CON组和15%HFD组相比,25%HFD组大鼠膝关节软骨的破坏程度显著增高,差异具有统计学意义(p<0.05)。高脂饮食促进OA炎症反应:在高脂饮食OA大鼠中,与CON组相比,15%HFD组OA炎症相关指标MMP-3和MMP-13的mRNA和蛋白表达显著上调,差异具有统计学意义(p<0.05),抑制OA炎症相关的COL2A1 mRNA和蛋白表达显著下调,差异具有统计学意义(p<0.05)。与CON组和15%HFD组相比,25%HFD组MMP-3和MMP-13的mRNA和蛋白表达显著上调,COL2A1的mRNA和蛋白表达显著下调,差异具有统计学意义(p<0.05)。高脂饮食产生的脂毒性促进大鼠软骨组织细胞凋亡:在高脂饮食OA大鼠中,与CON组相比,15%HFD组促凋亡因子(GADD153、p-JNK、Bax)表达上调(p<0.05),抗凋亡因子Bcl-2表达下调(p<0.0Oral microbiome5);与CON组和15%HFD组相比,25%HFD组促凋亡因子(GADD153、p-JNK、Bax)表达显著上调(p<0.05),抗凋亡因子Bcl-2表达显著下调(p<0.05)。在PA处理的关节软骨细胞中,大鼠软骨细胞凋亡水平随着PA浓度的增加而增加,与Vehicle组相比,400-1000μmol·L-1浓度的PA即可引发软骨细胞凋亡,差异具有统计学意义(p<0.05)。高脂饮食产生的脂毒性促进大鼠软骨组织细胞ERS的发生:在高脂饮食OA大鼠中,与 CON 组相比,15%HFD 组 ERS 通路相关因子(BIP、p-IRE1、XBP1s、ATF6、p-PERK、p-eIF2α、ATF4)的蛋白表达增加,差异具有统计学意义(p<0.05),与CON组和 15%HFD 组相比,25%HFD 组 ERS 通路相关因子(BIP、p-IRE1、XBP1s、ATF6、p-PERK、p-eIF2α、ATF4)的蛋白表达增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。抑制PERK通路可最大程度改善高脂饮食对软骨组织细胞的伤害作用:流式细胞术和TUNEL染色结果表明,给予ERS通路抑制剂后,抑制PERK通路可最大程度减轻PA引起的软骨细胞凋亡(P<0.05)。体内实验也表明,抑制PERK通路在25%HFD大鼠中表现出最显著的软骨组织细胞凋亡减轻(P<0.05),抑制PERK通路也能最大程度地减轻25%HFD组大鼠OA所致的关节软骨破坏(P<0.05)。研究结论1.高脂饮食大鼠OA的严重程度随着饮食脂肪含量的增加而加重。2.高脂饮食产生的脂毒性通过激活ERS引起软骨细胞凋亡,在DMM大鼠OA的发病中起重要作用。3.抑制PERK通路可以最大程度地减轻脂毒性引发的软骨细胞凋亡,进而减轻OA。