目的:本研究旨在鉴定小鼠骨细胞样细胞系MLO-Y4细胞间的隧道纳米管(tunneling nanotubes,TNTs),分析其形态学特性、成分和形成机制等一般特性,探究影响TNTs形成的因素,如营养、p H和氧化应激等应激条件,并进一步分析其物质运输特性,以期为了解骨组织中骨细胞及其通讯网络的结构和功能提供更加全面的理论基础。方法:1.骨BYL719纯度细胞间TNTs的鉴定及其一般特性研究培养MLO-Y4小鼠骨细胞样细胞系,使用鬼笔环肽标记纤丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin),DAPI标记细胞核,于激光共聚焦显微镜下鉴定MLO-Y4细胞间的TNTs,并分析其长度、直径、有无分支和连接形式等形态学特性。使用抗α微管蛋白抗体标记细胞骨架α微管蛋白,进一步分析MLO-Y4细胞间TNTs的成分。使用活细胞成像系统,研究MLO-Y4细胞间TNTs的形成机制。分别将MLO-Y4细胞置于含0、0.25、0.5和1μmol/L细胞松弛素B的培养液中培养24小时,观察含TNTs的细胞百分比和平均每个细胞含有的TNTs数量。2.骨细胞间TNTs形成的影响因素分别将MLO-Y4细胞置于低血清培养液、酸性培养液及低血清的酸性培养液中培养24小时,观察含TNTs的细胞百分比和平均每个细胞PF-6463922采购含有的TNTs数量。分别将MLO-Y4细胞置于含100和200μmol/L H_2O_2的氧化应激培养液中培养24小时和2小时,观察含TNTs的细胞百分比和平均每个细胞含有的TNTs数量。3.骨细胞间TNTs的物质运输作用研究使用DiD标记的MLO-Y4细胞作为供体细胞,使用EGFP转染的MLO-Y4细胞或未标记的MLO-Y4细胞作为受体细胞,将其按1:1的比例共培养24小时,观察DiD阳性的受体细胞情况;为了进一步量化直接通讯或间接通讯介导的物质运输,设置条件培养基组后,通过流式细胞术检测DiD阳性细胞百分比,计数受体细胞中DiD阳性细胞的百分比。使用DiD标记的供体细胞与EGFP转染的受体细胞或未标记的受体细胞按1:1的比例共培养16～24小时,使用活细胞成像系统配合DIC观察供体细胞与受体细胞间TNTs的形成及其所介导的囊泡运输。结果:1.骨细胞间TNTs的鉴定及其一般特性研究通过荧光染色,利用激光共聚焦显微镜结合三维重建,鉴定MLO-Y4细胞间的TNTs,其鉴定标准为:至少连接两个细胞,含有F-actin,不与培养皿底部接触。我们在MLO-Y4细胞中所鉴定的TNTs平均直径为366 nm(210～1430 nm),平均长度为5.7μm(1.1～129μm)。大多数的TNTs(97.5%)无分支结构,少数(2.5%)有分支。TNTs的形成可在树突之间(5genetic risk2.1%)、树突与细胞体之间(42.4%)以及细胞体之间(5.5%),且通过细胞体之间连接的TNTs,其直径和长度均明显大于另两种类型的TNTs。除含有F-actin外,在MLO-Y4细胞间较粗的TNTs还含有α微管蛋白。MLO-Y4细胞间TNTs的形成机制包括细胞移动机制及突起伸长机制。与对照组相比,在0.5和1μmol/L的细胞松弛素B作用24小时后,含TNTs的细胞百分比和平均每个细胞含有的TNTs数量均明显减少。2.骨细胞间TNTs形成的影响因素与对照组相比,MLO-Y4细胞在低血清培养液、酸性培养液及低血清的酸性培养液中培养24小时后,含TNTs的细胞百分比和平均每个细胞含有的TNTs数量均明显增加,且与单独的低血清培养液或酸性培养液培养相比,低血清的酸性培养液培养的MLO-Y4细胞含TNTs的细胞百分比更多。与对照组相比,MLO-Y4细胞在含200μmol/L H_2O_2的氧化应激培养液中培养24小时,含TNTs的细胞百分比明显增多。3.骨细胞间TNTs的物质运输作用研究在DiD标记的供体细胞与EGFP转染的受体细胞共培养24小时后,大多数的受体细胞内均含有DiD标记的囊泡。为了进一步对间接通讯和直接通讯这两种通讯方式进行量化,使用DiD标记的供体细胞与未标记的受体细胞共培养,流式细胞术检测结果发现,与两种细胞共培养0小时相比,共培养24小时后,受体细胞中DiD阳性细胞的百分比显著增加;为了排除细胞之间的间接通讯作用,将供体细胞的条件培养基加入受体细胞中培养24小时,结果发现,与细胞直接共培养24小时相比,受体细胞中DiD阳性细胞百分比明显减少。在DiD标记的供体细胞与EGFP转染的受体细胞共培养16～24小时后,供体细胞与含供体细胞来源DiD的受体细胞之间存在TNTs。在DiD标记的供体细胞与未标记的受体细胞共培养16～24小时后,可观察到DiD标记的囊泡在TNTs内不断运动,并且有囊泡从一个细胞内通过TNTs向另一个细胞内直接运输。结论:1.MLO-Y4骨细胞间存在TNTs结构,其形态学特性具有骨细胞特异性。2.低营养、酸性p H或氧化应激等应激条件可促进MLO-Y4骨细胞间TNTs的形成。3.MLO-Y4骨细胞可通过TNTs进行直接物质运输。