研究背景和目的:脑缺血是一种能够严重威胁人类健康的疾病,具有较高的致死率以及致残率。及时的血管再通治疗是缺血性卒中最有效的治疗方法,然而该治疗的时间窗只有3-4小时,因此有许多患者得不到及时有效的治疗。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),在缺血性脑损伤中具有神经保护以及促血管生成的作用,但其靶向递送到缺血性脑损伤部位仍存在困难。结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)在脑缺血损伤发生后持续上调,是脑缺血治疗及给药的潜在靶点。后续通过体内噬菌体展示技术找到靶向肽CFBP可特异性与CTGF靶向结合,本研究设计构建并制备了重组CFBP-bFGF蛋白,CFBP-bFGF可通过与靶向结合缺血脑组织中上调的CTGF,特异性引导bFGF递送至缺血脑损伤部位。最后,我们进一步探索了CFBP-bFGF在大鼠脑缺血再生修复中的作用。研究方法:1.通过基因工程设计并通过镍柱纯化制备CFBP-bFGF重组蛋白,运用Western blot以及SDS-page检测蛋白表达纯度。2.用MTT法检测人皮肤成纤维细胞(HSFs)的体外增殖能力来检测CFBP-bFGF重组蛋白的活性;用PC12细胞构建OGD/R模型来验证CFBP-bFGF能够靶向缺氧产生CTGF的神经元,并起到保护作用。3.用凝胶海绵在大鼠背部进行皮下包埋,分为负载PBS、等量bFGF和CFBP-bFGF;14天后取出组织块进行HE以及α-SMA染色,验证CFBP-bFGF在体内的生物学活性。4.线栓法制备右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,分为PBS组,bFGF组,CFBP-bFGF组。使用Elisa、Western blot及小动物活体成像检测缺血损伤部位CTGF的表达;并使用免疫荧光检测CFBP-bFGF与CTGF在缺血脑组织中的共定位表达。5.通过旷场、转棒等行为学检测方法评估大鼠运动功能恢复情况。6.H&E及尼氏染色用于检测脑缺血部位的病理学变化。免疫荧光用于检测脑缺血损伤部位的炎症反应、血管再生、细胞凋亡及神经元存活的EPZ-6438作用情况。其中,NeuN抗体用于标记神Chronic care model Medicare eligibility经元存活的情况;vWF抗体用于检测缺血脑组织的血管生成情况;CD68抗体用于检测巨噬细胞炎症反应;TUNEL染色用于评估缺血损伤部位细胞凋亡情况。7.提取组织蛋白,用Western blot检测凋亡相关蛋白以及bFGF调节的下游通路相关蛋白的表达;BCL-2、Caspase-3抗体用检测凋亡情况,ATK/p-AKT用于检测CFBP-bFGF对下游通路的调节。研究结果:1.Western blot和SDS-page检测结果显示CTGF-bFGF重组蛋白的分子量约为21KD,略大于bFGF。2.MTT法检测HSFs的体外增殖实验中,细胞在含有相同梯度浓度的bFGF、CFBPbFGF融合蛋白的培养液中培养2天,bFGF、CFBP-bFGF融合蛋白均具有相似的促进HSFs细胞体外增殖的能力,说明融合CFBP短肽后,CFBP-bFGF的生物学活性并未收到影响;此外,文献报道PC12细胞缺氧后,CTGF的表达量上调。后续PC12细胞在含有相同梯度浓度的bFGF、CFBP-bFGF融合蛋白的培养液中培养,低氧6h后复氧18h,结果显示低浓度的CFBP-bFGF以及bFGF对于低氧损伤的PC12细胞保护作用相似,但高浓度的CFBP-bFGF的保护作用要优于bFGF,我们推测CFBP-bFGF可通过靶向结合缺氧损伤后上调的CTGF,更好的发挥其保护作用。3.Western blot检测到大鼠背部皮肤损伤后CTGF上调表达,并且检测到CFBPbFGF靶向于损伤部位,证明CFBP-bFGF可以靶向不同部位产生的CTGF;大鼠背部皮下包埋14天后切片染色观察,结果显示CFBP-bFGF表现出优于bGefitinib-based PROTAC 3临床试验FGF的成血管功能,结合CFBP-bFGF对CTGF的靶向,证明CFBP-bFGF靶向损伤部位产生的CTGF,并且维持有效浓度,更好的发挥bFGF的生物学活性。4.通过线栓法制备MCAO模型,大鼠完全清醒后采用Zea-Longa评分,将评分为1-3分的大鼠纳入后续实验。提取蛋白检测CTGF表达,结果显示于术后3天高表达。采用荧光染料标记蛋白,尾静脉注射后进行小动物活体成像,结果显示CFBPbFGF能够在脑部聚集;随后进行冰冻切片,结果显示,损伤的右脑有更高的荧光强度,提示CFBP-bFGF能够更好的在缺血右脑聚集;后续通过bFGF/CTGF免疫荧光双染进一步确认CFBP-bFGF能够更好的与缺血区上调的CTGF共定位,提示CFBP-bFGF能够靶向结合于脑缺血损伤产生的CTGF。5.术后1周和2周进行行为学检测,包括旷场实验和转棒,结果显示CFBP-bFGF组大鼠运动功能的恢复较bFGF组和PBS组好。6.2周后取脑制备石蜡切片,HE染色、尼氏染色可见CFBP-bFGF组梗死区细胞坏死程度较bFGF组和PBS组轻;CD68、vWF、NeuN的免疫荧光,结果显示CFBP-bFGF组能更好的减轻炎症反应、促进血管的生成以及保护神经细胞,进而保护脑组织。7.2周后脑组织石蜡切片进行TUNEL染色,结果显示CFBP-bFGF能有效的抑制细胞凋亡。2周后脑组织提取蛋白进行Western blot实验,用BCL-2、cleaved Caspase-3、ATK/p-AKT抗体进行检测,结果显示CFBP-bFGF组能更好的抑制凋亡的表达,并且可能通过ATK/p-AKT这一通路发挥其相关生物学效应。结论:综上,重组CFBP-bFGF融合蛋白可以靶向缺血脑损伤高表达的CTGF,使bFGF在脑缺血损伤部位富集,因此能更有效的减轻炎症反应、促进血管的生成、减少神经元凋亡,进而改善脑缺血损伤大鼠的运动和肢体协调能力,为脑缺血提供了一种有效的再生修复治疗策略。