转录调控是各个蛋白、细胞、组织等在发挥其功能时对基因的翻译表达的特定的调节形式,是生物大分子在发挥生命活动时的的必要环节。一方面,它可以通过完全停止转录来对特定基因的表达进行限制;另一方面,它也可以通过激活转录,进而激活某些只在特定环境条件下表达的基因。而且,这些转录调控还可以通过不同的翻译后修饰来发生。转录调控对于生物的各项生命活动功能发挥起到了至关重要的作用,其涉及到许多不同通路和转录因子。转录调控涉及到的生物学过程非常广泛,从可变剪切到DNA修复,蛋白的表达,细胞组织的分化与再生到组织癌症的产生和耐药都能和转录调控关系密切。Hippo信号通路最早在果蝇的基因中被发现,其在哺乳动物体内高度保守。该通路与细胞生长,分化和发育有关,其功能在早期胚胎发育、组织稳定性维持和器官大小控制及再生等均起到关键作用。它通过调节组织生长和细胞分化,被认为是组织稳态和器官大小的中心调节通路。该通路与它的激酶组分之一(Hippo,或哺乳动物中的MST1/2)同名,由于在通路突变实验中观察到的过度生长表型而得名。其主要是通过对其成员之间上下游蛋白的转录调节信号传递,招募及共激活等发挥作用。YAP是Hippo信号通路的关键蛋白,该蛋白自身结构中无DNA结合结构域。研究表明,一旦Hippo对应的通路出现异常情况,YAP就会进入到细胞核内部;然后和Hippo信号通路末端关键调节蛋白,转录增强因子TEADs(Transcriptional enhancer associated domain family members)进行结合,形成异源二聚体复合物,进而直接影响下游基因自身的转录。TEADs能招募YAP/TAZ、VGLL等转录共激活因子,可调控包括CTGF、Cyr61、AXL、Myc、Gli2和BIRC5等不同的促癌基因表达,并且也在肿瘤标志物间皮素激活过程中发挥了关键作用。众多临床数据分析结果表明,TEAD是非常关键的肿瘤标志物。TEAD各个家族成员在结肠癌、乳腺癌和前列腺癌等多种不同的癌症中都有很高的表达,进一步的分析发现其表达的异常和突变也是重要的临床不良预后的标志。组蛋白的乙酰化修饰也是表观遗传中基因转录调控的重要机制之一。组蛋白翻译后修饰可以在真核生物体内引起的染色质结构发生变化,改变染色质的组成造成染色质重塑,染色质的重塑可以改变转录因子与其染色质DNA的结合从而启动或者抑制相关基因的表达。在众多表观遗传调控中,组蛋白的乙酰化修饰调控在基因表达调控的过程中起到了关键的作用。针对组蛋白乙酰化的修饰发生过程进行探究表明,大多数情况下经过组蛋白乙酰化酶“Writer”来催化组蛋白上的赖氨酸乙酰化,激活基因转录再由去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)Eraser来去除乙酰化。Bromodomain(BRD)家族的蛋白可以对其特定的赖氨酸乙酰化修饰进行识别,是可以与其结合的唯一的结构域,包含这个结构域的蛋白被叫做“溴蛋白家族”。其家族成员根据其结构和功能的相似性,有8个家族。由于组蛋白乙酰化状态的失衡与肿瘤发生密切相关,近几年来,对其抑制剂的发现与开发,发展迅速。该靶标家族涉及包括癌症等多种重大疾病,靶向该家族蛋白的多个药物都已经进入临床试验。本论文基于靶向调控相关转录蛋白的小分子抑制剂的发现,以Hippo通路重要转录因子TEAD及组蛋白赖氨酸乙酰化的识别蛋白BET家族BD2,这两个具有潜在成药性的新型靶标为切入点,结合药物设计,体外高通量化合物的筛选,化学合成和改造以及药理学等手段展开研究。本论文的第一部分工作,靶向TEAD-YAP相互作用建立并Rapamycin纯度优化基于Alpha Screen技术的高通量筛选平台,并一步通过多种生物实验验证,获得其先导化合物。首先,通过优化pH条件、盐浓度、表面活性剂等理化条件,获得了具有较高通量和灵敏性的高通量筛选体系,为发现靶向TEAD-YAP相互作用PPI界面的小分子抑制剂提供Enzymatic biosensor方法基础。进而,我们运用该方法,对本实验室内部的天然产物库进行高通量筛选,获得苗头化合物DCTEAD06,共IC50值为19.9 ±3.0 μM。接着,通过假阳性排除,并利用蛋白热迁移实验、表面等离子共振等实验,确证TEAD4与DCTEAD06的结合。接着,通过细胞实验,证明DCTEAD06可以抑制结肠癌细胞HCT116的增殖,诱导细胞凋亡。然后,运用萤光素基因报告实验,发现了其可以抑制TEADs对下游靶基因的转录活性。因此,在这一章工作中我们开发和优化了可以对TEAD4-YAP结合进行高通量小分子抑制剂筛选的AlphaVX-661体内实验剂量 Screen方法平台,并且发现了新型骨架结构的TEAD4-YAP的小分子抑制剂化合物。通过体外结合模式和细胞水平作用探索,为下一步化合物的结构和活性的优化提供了有效的指导,并且也为其他TEAD家族的小分子抑制剂化合物提供了可靠的筛选技术平台。在之前的工作中我们对TEAD4-YAP的抑制剂进行了筛选发现,但是由于该界面空间狭长且亲和力较高,往往现有的小分子抑制剂的活性不高,并且改造的难度较大。近几年来研究发现TEADs在生理条件下其保守半胱氨酸位点会发生自棕榈酰化,TEADs的自棕榈酰化对其稳定性和功能非常重要。因此,我们在第二部分的工作中靶向TEADs自棕榈酰化位点,开展其先导化合物发现与验证研究。首先,利用基于活性的蛋白谱技术Click实验对本实验室内部的共价化合物库进行了筛选,获得了具有TEAD1/3选择性骨架新颖小分子抑制剂DC-TEADin1072。其次,利用基于蛋白与小分子共价对接方式,分析蛋白和小分子的结合模式。进而,分析了 TEADs家族蛋白内部存在的氨基酸差异,最终获取了 TEAD1和TEAD3双靶点抑制剂DC-TEADin1072。该抑制剂为新型TEAD1和TEAD3选择性共价抑制剂,IC50分别为0.61±0.02 μM和0.58±0.12 μM。经质谱分析和蛋白位点突变检测证实该蛋白在TEAD1 C359和TEAD3 C371位点与半胱氨酸结合。最终,在斑马鱼的动物实验表明,该类化合物对动物的发育产生明显影响。基于上述发现的TEAD1和TEAD3的双靶点抑制剂,我们通过序列和晶体结构比对等多种方式,开展基于结构的药物化学优化,最终得到了选择性更强专一的TEAD1或者TEAD3抑制剂。根据文献,我们发现对TEAD3的生理功能研究较少,现阶段缺乏一个选择性高活性较好的化学探针,以探索TEAD3的功能。我们对DC-TEADin1072结构进行了化学优化得到了 DC-TEAD3in03化合物。为进一步证实TEAD3在细胞中的选择性抑制作用,用GAL4-荧光素报告基因验证TEAD3对GAL4-TEAD1-4荧光化信号的抑制作用,其在TEAD3活性为1.15 μM。动物实验表明,DC-TEAD3in03与TEAD3的共价结合抑制了斑马鱼的生长,并证实TEAD3与发育功能有关。本部分的工作,我们基于化合物的筛选发现TEAD1和TEAD3双靶点抑制剂,并以此为起点针对TEADs家族晶体结构的分析与比较,应用药物化学优化发现了选择性TEAD3的共价小分子抑制剂,在细胞内也可以实现对TEAD3选择性的转录活性抑制。以斑马鱼为模型将TEAD1和TEAD3双靶点抑制剂作为对照,研究其对发育的影响,发现的抑制TEAD1/3可以抑制影响斑马鱼整体的生长速率,TEAD3抑制剂特定的影响其尾鳍的生长速率。证明了TEAD3生物发育方面的重要性,也揭示了TEADs家族不同成员调控的基因的差异,对TEADs其他家族成员选择性抑制剂的开发和不同转录因子的具体生理病理功能提供了化学探针。本论文最后的部分内容主要涉及到组蛋白乙酰化识别因子BET家族BD2选择性抑制剂作用机制的研究。组蛋白赖氨酸乙酰化识别因子Bromodomain是非常重要的癌症治疗靶标,其中以BET家族为代表,主要包括BRD2,BRD3,BRD4和BRDT为家族成员。BET家族的蛋白包含了BD1和BD2两个Bromodomain结构域。近年来,选择性抑制BET BD2成为一种很有前途的药物发现策略。尽管在这一领域取得了重大进展,但对配体—蛋白复合物结构、基因表达改变的差异以及选择性BET BD2抑制剂体内具体发挥作用的机制研究仍然很少。我们建立了AlphaScreen方法来检测和验证抑制剂的活性和选择性倍数。通过化合物与BD1和BD2高分辨率共晶体结构阐明其具体的结合模式,为BET家族BD2选择性提供了坚实的结构基础。非常值得关注的我们也第一次确定了外环芳香胺类化合物是一类新型的选择性抑制BET BD2的骨架,这为改造合成新BET BD2选择性抑制剂提供了思路。此外小鼠肿瘤模型中显示,BY27显示出67%的肿瘤生长抑制作用,与目前处于Ⅱ期临床试验中的pan BET抑制剂Ⅰ-BET762相当,它在高剂量下对小鼠的毒性更小。这些结果表明靶向选择性BET BD2抑制剂的开发具有极佳的体内抗肿瘤活性和安全性。