非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引发的一种猪烈性传染病。常表现为发热、厌食、精神沉郁等临床症状,感染4～15天病死率接近100%。ASF始发于1921年的肯尼亚,并在非洲大陆流行,之后向欧洲、美洲蔓延;2018年传入我国东北地区,并迅速蔓延全国,造成了巨大的经济损失,严重危害我国生猪产业的发展。鉴于ASFV复杂的生物学特性,且对其毒力相关基因、复制致病及免疫逃逸/耐受机制等知之甚少,严重制约了安全有效疫苗和药物的研发进度。ASFV作为一种病毒,属于专性细胞内寄生物,缺乏完整的生命系统,必须通过“劫持”宿主翻译系统为病毒蛋白合成服务。其中翻译起始因子e IF2α作为翻译调控的核心节点,控制细胞应激反应和翻译重编程走向,对病毒毒力、嗜性、致病性及免疫逃逸等具有重要影响,e IF2α磷酸化调控无疑是病毒与宿主细胞竞争翻译资源的重要阵地之一。然而,关于ASFV编码蛋白与e IF2α磷酸化作用关系的认知极度匮乏。聚焦这一科学问题,本研究主要从selleck RP56976以下方面展开:1、ASFV isolate China/2018/Anhui XCGQ株编码蛋白调控e IF2α磷酸化的筛选本研究前期利用ATF4荧光素酶报告系统对ASFV isolate China/2018/Anhui XCGQ株编码蛋白进行筛选,发现有39个能够显著上调e IF2α磷酸化,22个能够显著下调e IF2α磷酸化。筛选发现MGF110家族成员上调e IF2α磷酸化水平的功能最为显著,其中MGF110-5L-6L和MGF110-9L具有更为显著的调控作用。2、ASFV MGF110-5L-6L蛋白诱导宿主细胞翻译阻滞和应激颗粒形成的作用机制选取猪肺泡巨噬细胞3D4/21和猪肾细胞PK-15作为研究用细胞系,利用质粒转染和特异性化学药物处理等方法,结合免疫印迹和激光共聚焦显微镜等检测技术,验证了MGF110-5L-6L蛋白与e IF2α磷酸化及其下游翻译效应之间的功能关系。随后,通过生物信息学网站预测、亚细胞定位和功能分析等SCH772984作用,研究了MGF110-5L-6L蛋白与诱导细胞应激之间的相关性。试验结果表明,MGF110-5L-6L能够显著激活e IF2α通路,引起细胞内e IF2α磷酸化水平及激活转录因子ATF4表达量升高,诱导综合应激反应的发生;还可诱导细胞发生内质网应激和未折叠蛋白反应,并通过活化PERK和PKR激酶来诱发e IF2α的磷酸化,进而导致细胞蛋白翻译阻滞和应激颗粒形成。进一步证实,MGF110-5L-6L蛋白含有两个高度保守的半胱氨酸基序,且主要定位于内质网,少量分布于高尔基体、线粒体和溶酶体,还可诱导高尔基体和过氧化物酶体的亚细胞定位及形态出现显著改变,提示其可能通过影响内质网腔中氧化还原稳态、蛋白分泌途径或相关膜性细胞器发生等创造应激条件。3、ASFV MGF110-9L蛋白诱导宿主细胞翻译阻滞和应激颗粒形成的作用机制在筛选结果中MGF110-9L蛋白激活e IF2α磷酸化及其下游通路较为显著,且其参与调控宿主翻译的作用机制尚不明确。通过生物信息学网站预测、亚细胞定位和功能分析表明MGF110-9L蛋白包含一个高度保守的半胱氨酸基序,且主要定位于内质网,少量分布于高尔基体、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体中,与MGF110-5L-6L蛋白相似。本研究发现,MGF110-9L能够诱导e IF2α磷酸化及其下游ATF4、CHOP蛋白表达量的显著升高,诱导综合应激反应的发生;还可诱导细胞发生内质网应激,通过PERK、IRE1和ATF6三条分支激活未折叠蛋白反应,由PERK和PKR激酶激活引起e IF2α磷酸化,导致细胞翻译阻滞和应激颗粒的形成。本研究首次报道了ASFV早期蛋白MGF110-5L-6L、MGF110-9L的结构、亚细胞定位及其潜在功能特征,揭示了MGF110-5L-6L、MGF110-9L蛋白与e IF2α磷酸化和宿主细胞蛋白翻译系统之间的功能关系,Drinking water microbiome为进一步阐明病毒的复制翻译机制,深入认识ASFV的病原生物学与致病机制提供了新的科学参考。