胶原蛋白是动物体内各种组织和功能所必需的基质蛋白,在生物材料领域有广泛的应用。纤维胶原蛋白中有着保守的Gly-X-Y序列,称为标准三重子,非纤维胶原序列天然存在多个非标准三重子,这样的三重子在纤维状胶原中会引发病理性突变。本研究结合实验与分子动力学模拟解析了纤维和非纤维状胶原蛋白中的非标准三重子对其结构以及性质影响的机制,为胶原蛋白的序列设计及生物合成提供理论参考。本论文以类胶原多肽以及重组胶原蛋白作为研究平台,通过在主体模型中引入成骨不全症突变位点以及天然中断序列,构建一系列突变个数可调控的https://www.selleck.cn/products/azd6738.html客体胶原分子模型。结合分子动力学模拟与热稳定性表征,解析胶原蛋白解折叠机制,探究突变在局部以及整体上的影响,利用局部氢键作用力对螺旋的热稳定进行预测。同时将突变模型引入重组胶原蛋白进行体外表达,得到带有非标准三重子的胶原分子,研究突变与中断序列对长链胶原中的影响。主要内容如下:(1)结合实验与模拟解析一种非标准三重子(Gly→Ala)对纤维状胶原蛋白结构的破坏作用。基于更接近天然胶原的异源三聚体模型(abc),3条链中分别引入Gly→Ala突变,构建7种突变体。圆二色谱与差示扫描量热结果表明,单点突变体T_m值降低15°C,双点突变体T_m值降低超过25°C,三点突变体未形成三螺旋结构。从分子动力学轨迹中提取主链氢键与侧链盐桥成键概率,表明突变位点的作用力受到扰动,成键概率下降。成功构建一个函数,显示主链氢键成键概率的乘积与热稳定COVID-19 infected mothers性高度相关(R~2=0.92)。利用梯阶模型分析分子动力学模拟轨迹,突变点附近梯阶参数值发生变化,表明三螺旋结构局部解折叠。氢键能量与结构形变分数具有高关联性(R~2=0.76),表明突变不仅破坏了氢键作用力,也导致了分子的弯曲与运动状态的变化。(2)结合实验与模拟解析4种具有不同侧链长度与疾病表型的非标准三重子对纤维状胶原蛋白结构的破坏作用。将不同侧链长度的氨基酸引入异源三聚体模型(abc),构建12种突变体。研究链特异性突变对胶原蛋白折叠状态的影响,解析侧链运动模式,得到胶原蛋白折叠时的局部氢键能量阈值。圆二色谱结果显示Ser突变体T_m维持在16°C附近,而其他的突变均会导致胶原三螺旋解折叠。分子动力学模拟轨迹显示突变体的稳定性降低主要是由骨架氢键的破坏引起的。基于氢键能量,得到了可以预测三螺旋折叠或展开的局部氢键能量阈值为-10.5 kcal·mol~(-1)。特别的,Val的引入会造成了三螺旋的解折叠,而具有相似侧链长度的Ser则没有。结构细节表明Ser中的侧链羟基与主链形成氢键,从而补偿突变体稳定性的降低。(3)模拟解析一种与Gly→Ala突变类似的非标准三重子(G5G天然中断)对非纤维状胶原蛋白结构的影响。将G5G天然中断与类似的Ala突变引入(POG)_9构建4种突变体,常规动力学模拟观BYL719试剂测到G5G天然中断比Ala突变存在更多的常规氢键破坏,在G5G中断序列中发现了CH···O弱氢键作用,二面角信息显示G5G模型可以在维持胶原结构的同时呈现更灵活的构象。对模型进行升温动力学模拟,观察到与实验一致的热稳定性差异,G5G天然中断比Ala突变解折叠温度要高50 K。解折叠结构的复折叠模拟显示G5G天然中断序列中的Ala有促进胶原结构折叠的作用。(4)以重组胶原蛋白为平台研究多种Gly突变与G5G天然中断等非标准三重子对胶原蛋白结构的影响。将来源于S.pyogenes的细菌胶原蛋白V-ABC作为主体模型,在其C端引入包含G5G天然中断与Gly突变的(PPG)_(10)序列,构建重组表达体系,并对发酵条件进行优化,最后对表达的重组胶原蛋白进行了热稳定性表征。结果表明,温度是影响重组胶原蛋白的表达主要因素,改变温度分段诱导会提高产量。圆二色谱结果显示,V-ABC-PPG蛋白的T_m值为38.4°C,带有G5G天然中断的胶原蛋白的T_m值约为37°C。带有Gly突变的胶原蛋白T_m值范围为33.4°C-36.5°C,表明G5G天然中断对重组胶原蛋白结构影响较小。