目的:通过使用H_2O_2处理人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),建立氧化应激诱导细胞衰老模型,筛选出抗衰老药物阿托伐他汀钙。通过使用化疗药物氟尿嘧啶处理HUVEC和正常人结肠上皮细胞(HIEC),探索氟尿嘧啶是否能导致正常细胞(HUVEC和HIEC)出现衰老。加入阿托伐他汀钙,进一步探索阿托伐他汀钙是否能够缓解氟尿嘧啶导致的细胞衰老;接下来,通过体外Kras阳性人结肠癌细胞株HCT116细胞实验和体内BALB/c nude异种移植肿瘤的动物实验,验证阿托伐他汀钙是否可以增强氟尿嘧啶的抗肿瘤疗效。方法:使用研究衰老的模型细胞HUVEC,建立H_2O_2诱导HUVEC细胞衰老模型,通过对美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的474个小分子化合物库中药物进行筛选,筛选出抗衰老药物阿托伐他汀钙。用1μmol/L氟尿嘧啶处理HUVEC和HIEC细胞共同孵育6天,建立衰老模型。为了进一步证明阿托伐他汀钙的抗衰老效果及寻找最适浓度,将不同浓度阿托伐他汀钙加入1μmol/L氟尿嘧啶处理的HUVEC和HIEC细胞中共培养6天,形态学上通过SA-β-Gal糖苷酶染色、Western blot检测、RT-q PCR检测、CCK-8检测等实验,观察到阿托伐他汀钙对氟尿嘧啶导致的细胞衰老有拮抗作用。选用6-8周龄BALB/c雄鼠,使用40mg/kg氟尿嘧啶在第2、4、6、8天进行腹腔注射(ip),建立氟尿嘧啶诱导的肠道损伤模型,在动物模型上探索阿托伐他汀钙能否缓解氟尿嘧啶导致的肠道损伤及其相关机制。为了探索阿托伐他汀钙的使用是否会影响氟尿嘧啶的抗肿瘤疗效,我们使用Kras阳性HCT116癌细胞,并且通过结晶紫实验和CCK-8实验证明了阿托伐他汀钙能够增强氟尿嘧啶的抗肿瘤疗效。接下来,选取8周龄BALB/c nude雄鼠,在其左大腿背部接种HCT116肿瘤细胞,通过治疗,探索阿托伐他汀钙能否增强氟尿嘧啶的抗肿瘤疗效。通过HE染色及免疫组化检测增殖指标(Ki-67,PCNA)及凋亡指标(Cleaved-caspase-3,Bcl-2),判断阿托伐他汀钙的联合抗肿瘤疗效。结果:1.在人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的氧化应激模型中,筛选出抗衰老药物阿托伐他汀钙。使用490μmol/L H_2O_2连续处理HUVEC细胞90分钟,换去完全培养基,在37℃和5%CO_2孵箱中孵育4天,构建氧化应激诱导的HUVEC细胞衰老模型。筛选抗衰老药物过程为:先使用H_2O_2处理HUVEC90分钟,换液后加入不同浓度阿托伐他汀钙,共同孵育4天后进行SA-β-Gal糖苷酶染色,实验中发现阿托伐他汀钙能够缓解H_2O_2诱导的HUVEC细胞衰老,在阿托伐他汀钙组中SA-β-Gal阳性细胞比例明显减少,在第3天,衰老相关蛋白p16及衰老相关基因(p53,p21,IL-1β,IL-6,TNF-α)m RNA的表达水平明显降低。2.阿托伐他汀钙可以缓解氟尿嘧啶诱导的HUVEC和HIEC细胞衰老。在HUVEC和HIEC细胞模型中,我们观察到,经氟尿嘧啶处理后,随着天数的增加,两株细胞均出现形态上的变大变扁等衰老表现,SA-β-Gal阳性细胞明显增多。在氟尿嘧啶诱导的HIEC细胞中加入阿托伐他汀钙后,观察到SA-β-Gal阳性细胞出现有明显统计学意义的下降,衰老相关蛋白水平及衰老相关基因的m RNA表达均出现有统计学意义的降低。实验结果表明,氟尿嘧啶能够导致HIEC细胞出现衰老,而阿托伐他汀钙可以缓解氟尿嘧啶诱导的HIEC细胞衰老。3.阿托伐他汀钙能够缓解氟尿嘧啶诱导人结肠上皮细胞衰老的机制研究3.1在体外,阿托伐他汀钙缓解氟尿嘧啶导致的HIEC细胞衰老依赖m TOR信号通路选用HIEC细胞,实验中发现最低浓度1μmol/L氟尿嘧啶能够诱导人结肠上皮细胞出现衰老,收集第1天和第3天的细胞蛋白样本,实验中发现,随着时间的推移,氟尿嘧啶逐渐激活m TOR信号通路,而阿托伐他汀钙与氟尿嘧啶联合组,m TOR的蛋白表达水平逐渐出现有统计学意义的下降。当加入m TOR激活剂胰岛素后,m TOR蛋白表达再次增加,逆转了阿托伐他汀钙导致的m TOR蛋白的减少,进一步证明了氟尿嘧啶通过激活m TOR信号通路来诱导细胞衰老。4.在BALB/c小鼠模型上,阿托伐他汀钙缓解氟尿嘧啶导致的肠道损伤的机制研究。腹腔注射氟尿嘧啶,建立BALB/c小鼠肠道损伤模型。通过观察小鼠的腹泻指数,体重,24小时进食量,24小时进水量,LY2157299试剂肠道组织病理学变化,结肠组织衰老相关基因m RNA的表达,以及p16的蛋白质表达水平等指标,来评估阿托伐他汀钙是否能缓解氟尿嘧啶导致的肠道损伤,上述结果均显示氟尿嘧啶组的小鼠肠道受到一定程度的损害,这种损害与氟尿嘧啶导致肠上皮细胞衰老有关,而阿托伐他汀钙能够缓解氟尿嘧啶导致的肠炎,这种修复损伤的功能与阿托伐他汀钙抗衰老作用密切相关。4.1在BALB/c腹泻小鼠模型上,阿托伐他汀钙缓解氟尿嘧啶导致的肠道损伤依赖m TOR信号通路。收集小鼠结肠组织蛋白质,Western blot实验证明氟尿嘧啶导致肠道损伤的过程中激活了m TOR信号通路,而阿托伐他汀钙能够通过抑制m TOR信号通路来缓解氟尿嘧啶对小鼠肠道造成的损害。4.2在体内、体外,阿托伐他汀钙依赖p65NF-κB和p38MAPK途径通过抗炎作用缓解氟尿嘧啶导致的肠道损伤。在HIEC细胞中,氟尿嘧啶能够激活炎症相关蛋白p65,p38的蛋白磷酸化通路,阿托伐他汀钙能够抑制氟尿嘧啶导致的p65,p38的蛋白磷酸化水平的升高,同时还降低了p65 NF-κB;p38MAPK信号通路介导的炎症因子IL-1β,IL-6 TNF-α的m RNA水平的表达,进而缓解氟尿嘧啶导致的肠道炎症。在BALB/c小鼠动物模型上,阿托伐他汀钙同样也明显降低了p65,p38的蛋白磷酸化水平及下游的炎症因子(IL-1β,IL-6 TNF-α)的m RNA的表达水平。以上结果均证明,阿托伐他汀钙通过抗衰老和抗炎作用来减轻氟尿嘧啶造成的肠道损伤。5.在HCT116细胞和BALB/c nude HCT116小鼠肿瘤模型中,阿托伐他汀钙增强了氟尿嘧啶的抗肿瘤疗效。5.1在体外,阿托伐他汀钙增强了氟尿嘧啶对Kras阳性HCT116细胞抗肿瘤活性。使用Cell Counting Kit-8细胞计数试剂(CCK-8)分别在第2天和第3天对HCT116的细胞活力进行测定。当不同浓度氟尿嘧啶单独处理HCT116细胞时,8μmol/L的氟尿嘧啶处理2天的HCT116细胞存活率在80%以上;8μmol/L的氟尿嘧啶处理3天的HCT116细胞存活率约60%;而当阿托伐他汀钙与氟尿嘧啶联合用药处理HCT116细胞时,随着阿托伐他汀钙浓度的增加,联合抗肿瘤活性明显增加。具体为5μmol/L阿托伐他汀钙联合8μmol/L氟尿嘧啶在第2天的细胞存活率接近于0。对于低浓度的阿托伐他汀钙联合用药,即1μmol/L、3μmol/L和5μmol/L阿托伐他汀钙分别联合5μmol/L氟尿嘧啶在第3天的致死率低于50%;联合8μmol/L氟尿嘧啶的致死率接近于100%。上述细胞实验说明,双药联合处理后,无论是第2天还是第3天,随着阿托伐浓度的逐渐升高,肿瘤的存活率接近于0,上述结果表明,阿托伐他汀钙增强了氟尿嘧啶的抗肿瘤活性。6.在体内,阿托伐他汀钙增强了氟尿嘧啶对BALB/c nude小鼠的肿瘤治疗效果。通过对BALB/c nude小鼠左大腿皮下接种HCT116细胞,待小鼠肿瘤体积至100mm~3进行抗肿瘤治疗,从接种HCT116开始,密切观察和测定肿瘤的大小,至对照组肿瘤增至1000-2000mm~3时,处死小鼠,分离肿瘤组织,进行石蜡包埋固定,切片,再进行HE染色和免疫组化检测。实验发现,与对照组相比,氟尿嘧啶能一定程度导致肿瘤减小,而阿托伐他汀钙联合氟尿嘧啶组的BALB/c nude小鼠肿瘤体积及体重显著小于氟尿嘧啶单独治疗组。免疫组化中增殖指标ki67,PCNA及凋亡治疗(Cleaved-caspase-3,Bcl-2)的检测结果同样表明,阿托伐他汀钙联合氟尿嘧啶双药的抗肿瘤效果明显优于单药。从小鼠体重变化曲线可以初步评定小鼠对阿托伐他汀钙的耐受性可,期间无小鼠因治疗导致死亡,治疗在安全范围内。结论:氟尿嘧啶是晚期结直肠癌患者应用最广泛的一线化疗药物,因其不良副反应,尤其中-重度腹泻,是导致抗肿瘤失败的主要原因之一,临床上对减少氟尿嘧啶导致的肠道损伤的治疗LEE011使用方法需求尚未得到满足,我们在BALB/c小鼠模型,研究了阿托伐他汀钙与氟尿嘧啶诱导的肠道损伤之间的关系。在本研究中,我们发现阿托伐他汀钙的肠道保护作用与缓解衰老,炎症有关。在实验中,我们观察到阿托伐他汀钙可以抑制HIEC细胞模型中的氟尿嘧啶诱导的细胞衰老。阿托伐他汀钙通过抑制动物模型中的衰老细胞积累、肠炎显著地缓解肠道损伤。同时,在氟尿嘧啶治疗期间给予阿托伐他汀钙治疗,将增强其抗肿瘤的疗效。此外,我们还观察到阿托伐他汀钙的这种作用与氟尿嘧hepatitis and other GI infections啶处理的细胞和BALB/c小鼠的肠道组织中m TOR信号通路的抑制密切相关。在BALB/c nude小鼠模型中,我们还确定了阿托伐他汀钙能够改善氟尿嘧啶的抗肿瘤效果。阿托伐他汀钙有望被开发成为一种新的减少患者肠道损伤的抗肿瘤药物,以满足临床的需要,为临床癌症患者的选药及用药提供过一种新的治疗策略和理论基础。