【研究背景】肾结石作为最常见的泌尿系统疾病之一,其患病率在全球逐渐增高,而我国成人肾结石患病率高达5.8%,大约每17人中就有1人受其影响。肾结石患者可表现为腰背痛、血尿、排尿困难等,甚至还表现为尿道梗阻、尿路感染,最终进展为慢性肾衰竭。草酸钙结石是最常见的肾结石类型,所占比例达70%-80%,缺乏有效的预防措施,5-10年复发率超过30%,15年的复发率高达75%。NOD样受体家族3(NOD-like receptors 3,NLRP3)炎症小体是由NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)组成的蛋白多聚体,可以通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别各种病原微生物和内源性危险信号,即病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)以及宿主来源的损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs),招募并激活Caspase-1,继而促进炎症因子IL-1β、IL-18的成熟和释放,在固有免疫防御、炎症反应过程中起着关键作用,参与了包括多种急慢性肾损伤在内的肾脏疾病的发生进展调控。大量实验表明,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作为一种具有巨大分化潜力的多功能干细胞,具有抑制炎症和免疫调节的作用。由于其免疫调节特性,MSCs对包括炎症性疾病和各种肝、肾、肺、心血管和神经系统疾病在内的广泛疾病显示出了很好的治疗潜力。研究显示MSCs能够募集到受损肾脏,并通过分化成肾实质细胞或释放细胞外囊泡来修复肾脏结构、改善肾功能。值得注意的是,MSCs可以通过抑制巨噬细胞NLRP3炎症小体的激活来缓解急性肺损伤和急性肝损伤。然而,MSCs是否能减轻草酸钙晶体沉积导致的肾脏损伤目前尚不清楚。【目的】本课题旨在通过细胞、动物实验探讨MSCs对小鼠肾脏草酸钙晶体沉积和细胞损伤的影响,并揭示MSCs通过调控巨噬细胞NLRP3炎症小体抑制乙醛酸诱导的肾脏细胞损伤和草酸钙晶体沉积的作用和机制,从而为草酸钙结石的预防和治疗提供新的理论依据和治疗靶点。【材料与方法】体内实验:首先通过腹腔注射乙醛酸溶液构建肾脏草酸钙晶体沉积的小鼠模型,同时通过尾静脉注射予以人骨髓来源间充质干细胞(bone marrow-derived macrophages,BMSCs)和人脐带来源间充质干细胞(umbilical mesenchymal stem cells,UMSCs)干预,设置对照组、乙醛酸造模组、造模+BMSCs干预组、造模+UMSCs干预组。通过HE染色、Pizzolato染色、免疫组化、实时荧光定量PCR、免疫荧光、TUNEL细胞凋亡检测实验等对肾脏组织切片进行分析,检测肾脏中草酸钙晶体沉积、炎症反应、NLRP3炎症小体活化和MSCs分布情况,探究两种人源MSCs对肾脏草酸钙晶体沉积和NLRP3炎症小体的影响。体外实验:通过脂多糖(LPS)及一水草酸钙晶体(COM)联合刺激诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)和人源巨噬细胞,同时分别将BMSCs、UMSCs与其共培养,设置对照组、COM刺激组、单纯BMSCs组、COM+BMSCs组、单纯UMSCs组、COM+UMSCs组6个组。通过Western Blotting检测巨噬细胞NLRP3炎症小体活化情况;通过ELISA对共培养后的条件培养基的炎症因子含量进行检测。同时,收集细胞培养上清液与小鼠肾髓质集合管细胞(mIMCD-3)共培养,进一步通过MTS细胞增殖实验检测巨噬细胞介导的MSCs对肾脏细胞的保护作用。【结果】1.BMSCs和UMSCs均能显著抑制乙醛酸诱导的小鼠肾脏草酸钙晶体沉积并改善肾功能HE染色、Pizzolato染色和偏光显微镜可观察到:与对照组相比,乙醛酸造模组小鼠肾脏出现大量草酸钙晶体沉积,肾脏结构破坏严重,肾功能明显减退,而BMSCs和UMSCs的干预均可显著抑制乙醛酸诱导的小鼠肾脏草酸钙晶体沉积,改善血肌酐、尿素氮等肝肾功能指标,拮抗乙醛酸对肾脏结构的破坏。2.BMSCs和UMSCs均能趋向草PR-171抑制剂酸钙晶体沉积的肾脏并减轻肾脏炎症小鼠肾脏组织的免疫荧光提示BMSCs和UMSCs均能募集到受损肾脏,免疫组化和q-PCR结果显示:与对照组相比,乙醛酸造模组小鼠肾脏组织炎症损伤相关标记物(MCP-1CCRG 81045溶解度、KIM-1、OPN、F4/80)和巨噬细胞极化标志物(CDistal tibiofibular kinematicsD80、CD86、CD163、IL-10)表达上调,而BMSCs和UMSCs干预可抑制上述炎症损伤相关标记物的上调,减少巨噬细胞募集和极化,减轻肾脏炎症。3.BMSCs和UMSCs通过抑制P65磷酸化拮抗草酸钙晶体诱导的肾脏NLRP3炎症小体活化小鼠肾脏组织免疫组化和q-PCR结果显示:BMSCs和UMSCs可通过抑制P65磷酸化拮抗乙醛酸诱导的NLRP3炎症小体活化。Western blotting展显示了类似的结果:COM晶体刺激可以激活小鼠BMDMs和人源巨噬细胞NLRP3炎症小体,而BMSCs和UMSCs均可通过拮抗P65的磷酸化及核转位,从而抑制巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化,进而抑制炎症因子IL-1β、IL-18的释放。4.BMSCs和UMSCs通过抑制巨噬细胞来源的促炎因子拮抗草酸钙晶体诱导的肾脏细胞损伤ELISA对MSCs和巨噬细胞的共培养模型收集的条件培养基检测结果显示:与对照组相比,COM晶体刺激促进巨噬细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-18,而BMSCs和UMSCs可以抑制COM晶体诱导的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-18的释放。mIMCD-3细胞暴露于COM晶体时的MTS细胞增殖检测实验显示:MSCs和巨噬细胞共培养的条件培养基可以拮抗COM晶体导致的肾脏细胞损伤。以上结果提示:BMSCs和UMSCs通过抑制巨噬细胞IL-1β和IL-18的分泌,从而达到保护肾脏细胞的作用。【结论】BMSCs和UMSCs均可通过抑制NF-κB通路的P65磷酸化拮抗NLRP3炎症小体激活,从而抑制乙醛酸诱导的小鼠肾脏草酸钙晶体沉积,减少巨噬细胞募集和炎症因子IL-1β、IL-18的分泌,保护肾脏细胞和改善肾功能。