造血作用(Haematopoiesis)是不同类型血细胞在造血组织中增殖、分化并释放的复杂过程。血淋巴细胞是无脊椎动物主要的免疫细胞,其增殖和分化是机体免疫防御的核心LXH254体内实验剂量基础,也是维持免疫稳态的关键。造血组织是重要的免疫器官之一,其能够为血细胞活动提供环境。目前为止,对于长牡蛎机体内造血作用相关的研究较少,其造血作用发生位点尚不明确,造血作用调控机制仍不清晰,这严重限制了对长牡蛎免疫、造血作用研究,并进一步影响到病害防控相关工作的展开。本研究采用生物信息学、分子生物学、细胞生物学和免疫学等技术方法对长牡蛎(Crmedieval Londonassostrea gigas)造血位点进行鉴定并对其造血作用调控机制进行深入研究,明确了长牡蛎造血作用相关分子特征及功能,初步鉴定了长牡蛎造血作用相关位点,并探究了血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)对长牡蛎造血过程的调控作用,取得如下结果:1.确认了长牡蛎造血作用相关分子特征其在血淋巴细胞增殖中的调节作用在长牡蛎中鉴定得到增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),ATP结合盒转运蛋白G2(ATP-binding cassette transporter G2,ABCG2),血管内皮生长因子VEGF及其受体VEGFR的同源分子,上述分子均含有保守的功能结构域。Cg PCNA和Cg ABCG2在长牡蛎鳃组织和性腺中表达水平较高,分别分布于血淋巴细胞的细胞核内和细胞膜上。Cg VEGF和Cg VEGFR在鳃组织和血淋巴细胞中均有较高水平表达,分别分布于血淋巴细胞的细胞质中和细胞膜上。造血相关细胞因子r Cg Astakine刺激后,长牡蛎无粒细胞及鳃组织内Cg PCNA表达水平显著上升,且鳃组织内Cg PCNA与Ed U标记在细胞核中可以共定位分布。采用RNAi技术抑制Cg ABCG2表达,发现Ed U阳性细胞占总血淋巴细胞比例降低,且处于S期的血淋巴细胞比例显著下降。注射r Cg VEGF后,血淋巴细胞和鳃组织中Ed U阳性细胞数量均显著增多。灿AZD1152-HQPA体内实验剂量烂弧菌刺激后,长牡蛎血淋巴细胞中Cg PCNA、Cg ABCG2、Cg VEGF和Cg VEGFR的m RNA表达水平均显著上升。结果表明上述分子可能参与长牡蛎血淋巴细胞增殖过程。2.发现了靠近绞合区鳃丝基部是长牡蛎造血位点将长牡蛎鳃组织分为8个不同区域,利用q RT-PCR技术检测造血相关转录因子、细胞周期相关分子以及免疫效应分子等在不同区域鳃组织中表达情况。结果显示,造血相关转录因子(Cg GATA,Cg SCL,Cg Runx)、细胞增殖相关细胞因子(Cg Astakine)、细胞周期相关分子(Cg PCNA,Cg CDK2)以及潜在干祖细胞标记分子(Cg SOX_2,Cg ABCG2)在靠近绞合区的鳃组织中表达水平高于其他区域,而免疫效应分子防御素(Cgdefensin-1,Cgdefensin-2,Cg Bigdefensin)及细胞因子(Cg IL17-3,Cg IL17-6)等在靠近绞合区的鳃组织中表达水平低于其他区域。组织化学染色检测结果显示靠近绞合区的鳃组织中部分细胞的细胞核呈近圆形,具有核质比较大的特征。且该区域存在大量Ed U阳性细胞,这类细胞主要富集于内鳃瓣普通鳃丝顶端。通过Ed U滞留标记方法检测到该区域内少量细胞在标记后较长时间仍可被Ed U染色,且呈干细胞标记(Cg SOX_2)阳性。结果表明靠近绞合区鳃丝基部是长牡蛎造血位点,Cg SOX_2阳性细胞可能是干祖细胞样细胞。3.明确了VEGF-VEGFR-MAPK通路在造血位点细胞增殖和迁移中发挥调控作用灿烂弧菌刺激后,造血位点内Cg VEGF和Cg VEGFR的m RNA表达水平显著上升。采用RNAi技术抑制Cg VEGFR表达后使用r Cg VEGF刺激,循环血淋巴细胞中细胞周期相关分子(Cg PCNA,Cg CDK2)及造血相关转录因子(Cg GATA,Cg Runx)表达水平显著下降,且循环血淋巴细胞中Ed U阳性细胞所占比例显著下降。同时,造血位点内Ed U阳性细胞聚集且数量上升。造血位点内MAPK通路中关键激酶Erk和p38的磷酸化水平显著下降,且造血相关转录因子(Cg SCL,Cg Runx)及细胞迁移相关基质金属蛋白酶(Cg MMP)表达水平显著下降,基质金属蛋白酶抑制剂(Cg TIMP)表达水平显著上升。采用RNAi技术抑制Cg VEGFR表达后使用VEGFR激动剂牛磺胆酸钠刺激,检测到循环血淋巴细胞中细胞周期相关分子、造血相关转录因子以及循环血淋巴细胞中Ed U阳性细胞所占比例下降。造血位点内Ed U阳性细胞聚集,MAPK通路中关键激酶Erk和p38的磷酸化水平显著下降,造血相关转录因子及细胞迁移相关分子表达变化。注射Brivanib或Semaxanib抑制Cg VEGFR磷酸化抑制剂后使用r Cg VEGF刺激,同样检测到循环血淋巴细胞及造血位点内相应变化。上述结果表明,Cg VEGF与受体结合后介导MAPK通路的激活并调节下游造血相关转录因子及细胞迁移相关基质金属蛋白酶表达,参与调控长牡蛎造血位点内细胞增殖及迁移。综上所述,Cg PCNA、Cg ABCG2、Cg VEGF和Cg VEGFR进化保守并参与长牡蛎细胞增殖的调节,长牡蛎造血位点位于靠近绞合区鳃丝基部,且VEGF-VEGFR-MAPK通路参与调控造血位点中细胞增殖和迁移过程。本研究为深入研究血淋巴细胞的发生发育过程及其在贝类免疫防御中的作用奠定了重要基础,并为水产动物疾病防控相关研究提供理论支持。