长江江豚(Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis,YFP)是一种极度濒危的淡水鲸类,现存1249头。尽管长江江豚的数量较之前有所恢复,但其濒危的状况仍未改变,并且病毒性疾病等因素尚属空白。因此本文以病毒宏基因组学等为方法,探究位于天鹅洲白鱀豚国家级自然保护区内长江江豚肛拭子样所包含的病毒多样化情况,研究长江江豚的病毒流行病学。并分别利用乳头瘤病毒E1与L1基因,为新发现的长江江豚乳头瘤病毒(Papillomavirus,NaPVs)建立检测方法以及构建包含主要衣壳蛋白L1基因的原核表达质粒。主要结果如下:1.通过宏基因组测序共鉴定出属于9个科的19种病毒,包括Papillomaviridae,Herpesviridae,Picornaviridae,Picobirnaviridae,Caliciviridae,Retroviridae,Parvoviridae,Virgaviridae,Narnaviridae及其他未分类的病毒。在上述病毒中,根据新发现的长江江豚疱疹病毒(Na HV)、嵴病毒(Na KV1-2)和乳头瘤病毒(NaPV1-6)的潜在致病性,以分子生物学的方法检测样本中病毒的携带情况,检测结果表明大多数长江江豚携带一种或多种病毒(52/58,89.7%)。并且嵴病毒和疱疹病毒显示出明显的年龄分布趋势,而PVs在长江江豚中显示出明显的性别差异特征。然后,根据乳头瘤病毒科各个属的物种划分标准,在长江江豚中发现了两个新的PVs种(指Omikronpapillomavirus 2和3)和4株新分离的PVs。进一步的进化分析表明,NaPVs占据粘wound disinfection膜生态位,并且病毒与宿主的共进化、复制、重组以及宿主转换事件的混合,共同驱动了鲸类PVs的进化。最后Regorafenib细胞培养,根据估算的长江江豚和其他鲸类中PVs的分化时间,反映了长江江豚初生物种的地位。总之,研究结果揭示了长江江豚中潜在的病毒种类、病毒流行情况以及演化历程,为病毒感染对长江江豚健康及繁衍的影响提供了研究方向。2.对6种NaPVs的全基因组序列进行多序列比对,选择最为保守E1基因为目的序列,并设计简并引物,通过扩增体系优化,建立了NaPVs检测方法。以上述6种病毒序列为模板,PCR扩增后测序,确定引物最佳退火温度为50℃,将测序正确的NaPV4基因序列连接至T载体,构建好的质粒以10倍比稀释,使拷贝数在1×10~(10)-1×10~0之间,最终确定该检查方法的灵敏度为10.6 copies/μL。3.以新发现的长江江E-616452分子式豚乳头瘤病毒2型(NaPV2)全基因组序列为模板,扩增其编码L1基因的区域,并连接至原核载体p GEX-4T-1-L1,对重组质粒进行双酶切鉴定及目的基因测序后转入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达,探究不同温度下融合蛋白的表达形式,并以GST亲和层析纯化可溶性蛋白。SDS-PAGE显示,在20℃下,NaPV2 L1-GST融合蛋白以可溶性和包涵体形式高效表达,相对分子质量约82 000。NaPV2 L1在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,为NaPV2 L1的疫苗制备奠定了基础。