该论文分为三个部分,第一部分是临床试验研究;第二部分为动物实验研究;第三部分是文献综述;临床试验研究部分观察了针刺法治疗强直性脊柱炎(AS)的可靠性、有效性及针刺法治疗AS的相关作用机制进行了思考和探究。动物实验研究部分将从AS与IL-23/Th17(白介素-23/辅助性细胞)炎症轴的角度观察探讨针刺治疗AS的作用机制的科学内涵,为针灸治疗AS效应研究及临床推广提供理论依据,最后综述部分从强直性脊柱炎(AS)的发病原因、发病机制、中医治疗、西医治疗以及IL-23/Th17炎症轴在AS中发挥的作用等方面进行论述。研究背景近年来,随着社会的进步和时代的发展,强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者在人群中发病率越来越高,并且越来越年轻化。流行病学研究表明,AS发病高峰为15～35岁,平均发病年龄为25岁左右,在小于8岁和大于40岁年龄段发病少见,男性多见。而强直性脊柱炎是一种慢性进行性炎症性自身免疫性疾病,是世界公认的难治病。一般认为该病由遗传、感染、环境因素、自身免疫及内分泌因素相互作用所致。其病变主要累及侵犯中轴关节,以骶髂关节炎、附着点炎和新骨形成为主要病理改变,严重者导致关节畸形和强直,因此,一般AS患者都伴随着脊柱活动及运动受限。而对于AS的治疗,目前尚缺乏根治的方案,治疗目的主要是缓解腰背部及关节疼痛、减轻炎症、延缓疾病的演变发展、改善脊柱活动及肢体运动功能情况,提高生活质量,防止脊柱疾病的并发症。但对于AS的发病机制仍不明确,因此,强直性脊柱炎的发病机制及治疗迫切需要新的研究和探索。前期的大量研究表明IL-23/Th17炎症轴及相关炎症细胞因子(包括IL-23、IL-17、TNF-α、CRP、ESR等)在AS的发展过程中发挥着重要作用,成为治疗AS的新靶点,并且导师组前期通过针刺治疗AS取得满意的效果,能够明显改善AS患者关节活动度,缓解腰背及关节疼痛等症状,但针刺治疗AS的作用机制尚未明确,并且未开展严格的动物实验及随机对照临床(Randomized controlled trial,RCT)试验,基于以上事实,本研究拟通过严谨的随机对照临床试验(RCT)及动物实验,系统观察针刺治疗AS患者的临床疗效及AS小鼠的临床表现和状态,并对其作用机制进行阐释。本实验来源于国家自然基金项目“基于IL-23/Th17免疫炎症轴探讨长蛇灸干预强直性脊柱炎的机制研究”(81960897)研究目的通过严谨的RCT试验,系统评价针刺对AS患者的临床疗效。采用牛软骨来源蛋白聚糖诱导AS动物模型(PGIA小鼠模型),通过观察IL-23/Th17炎症轴相关指标(TNF-α、IL-17、IL-23等),探讨针刺对IL-23/Th17轴的调控作用,为临床针刺治疗AS的有效性提供理论依据。研究方法1.临床研究:采用随机对照及单盲方法将来源于云南中医药大学第二、三附属医院的70例强直性脊柱炎患者随机分成针刺组和对照组,针刺组36例,对照组34例,对照组、针刺组均在联合用药基础治疗上进行。对照组予口服柳氮磺胺吡啶肠溶片及塞来昔布胶囊联合用药配合常规针刺治疗。塞来昔布胶囊:1粒/次,2次/日;柳氮磺胺吡啶肠溶片:第一周,1片/次3次/日;第二周,2片/次3次/日;第三周,4片/次3次/日;后面继续服用维持目前用药剂量,共治疗1个月;针刺(选穴主要以脊柱为主)治疗每天1次,连续治疗7次为一个疗程,每个疗程间隔休息3天,共治疗3个疗程即治疗1个月。针刺组在联合用药基础上给予经验穴针刺治疗(选穴主要以督脉、膀胱经、肾经为主),每日选1组穴位,交替使用,每天1次,连续治疗7次为一个疗程,每个疗程间隔休息3天,共治疗3个疗程即治疗1个月。采用强直性脊柱炎测量指数(BASMI)及Keitel功能试验评分量表对AS患者在治疗前、后分别进行评定,并且同时对外周血炎症因子进行检测,使用流式细胞术测定C反应蛋白(CRP)及血沉(ESR)表达水平,最后予上述量表及外周血炎症因子进行统计学处理。2.动物实验研究:本实验采用牛软骨来源蛋白聚糖在小鼠腹腔注射诱导小鼠关节炎模型(PGIA)作为强直性脊柱炎动物模型。将32只BALB/c小鼠随机分别设为空白对照组(N)、模型组(M)、针刺组(Z)和塞来昔布组(S),每组8只,除正常组外,其余24只均进行PGIA造模操作。分别于第0、20、40天在小鼠腹腔注射等量核心蛋白聚糖,同时予空白对照组小鼠腹腔注射等量0.9%生理盐水。造模后,在第41-70天期间,干预措施按实验设计要求进行[针刺治疗每周3次,隔天1次,治疗1月,共计12次]。实验结束后处理小鼠,行各项实验指标观察。主要实验观察指标包括:(1)采用国际动物关节评分量表进行小鼠关节肿胀评分;(2)采集血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)法测量TNF-α、IL-17、IL-23表达水平;(3)用HE染色法对小鼠骶骼关节、爪关节等进行组织病理学观察。研究结果1.临床研究(1)基线情况:本课题共纳入70例,脱落9例,1例剔除,脱落率12.85%,剔除率1.42%,最终完成有效病例60例(针刺组、对照组各30例)。两组AS患者治疗前在性别、年龄、量表评分(BASMI、Keitel功能试验)及炎性指标(CRP、ESR)经统计分析均无明显差异,差异无统计学意义(P>0.05),基线具有可比性。(2)量表评分测评:两组患者经治疗后,BASMI评分及Keitel功能试验评分较治疗前均显著降低,差异具有高度统计学意义(P=0.000<0.01);经治疗后,针刺组较对照组BASMI评分及Keitel功能试验评分均降低显著,差异具有高度统计学意义(P=0.002<0.01)。并且发现两组BASMI评分及Keitel功能试验评分都随着时间点走势变化而出现显著波动(P=0.000<0.01),并且两组在时间交互作用上有极显著影响,差异具有高度统计学意义(P=0.000<0.01),而针刺组较对照组BASMfinancing of medical infrastructureI评分及Keitel功能试验评分波动下降趋势更显著。评分量表证明了两组均可有效改善AS肢体运动度及脊柱活动度,而针刺组在改善肢体运动功能及脊柱活动方面优于对照组,证明了针刺组能有效改善AS患者肢体关节运动功能及脊柱活动度,防止关节僵硬变形,降低致残率。(3)外周血炎症因子水平表达:治疗后,针刺组与对照组较治疗前外周血CRP、ESR表达水平均降低,但对照组CRP下降趋势不显著,无统计学意义(P=0.069>0.05),ESR表达水平较治疗前显著降低,差异具有高度统计学意义(P=0.000<0.01);而针刺组治疗后较治疗前外周血CRP、ESR水平表达均显著降低,差异具有高度统计学意义(P=0.000<0.01);治疗后,针刺组与对照组比较,针刺组较对照组降低AS患者外周血ESR表达水平较明显,差异具有统计学意义(P=0.011<0.05),在抑制CRP表达水平方面,针刺组降低趋势更显著,差异具有高度统计学意义(P=0.000<0.01)。并且发现两组外周血CRP、ESR表达水平都随着时间点走势变化而出现显著波动(P=0.000<0.01),并且针刺组、对照组在时间交互作用上有极显著影响,差异具有高度统计学意义(P=0.000<0.01)。表明两组均可抑制外周血CRP、ESR表达水平,而针刺组在抑制炎症细胞因子方面优于对照组,进一步证明针刺可有效抑制炎症细胞因子表达水平,其作用机制可能与针刺具有抗炎作用有关。2.动物实验研究(1)关节炎评分:相对于空白对照组,予BALB/c小鼠经牛软骨来源蛋白聚糖免疫后,各组小鼠自发出现爪关节不同程度肿胀,关节炎评分显著增加,具有高度统计学意义(P<0.01),表明造模成功。治疗后,与模型组相比,针刺组与塞来昔布组小鼠关节肿胀评分均有所下降,针刺组下降趋势明显,差异具有统计学意义(P=0.047<0.05),而塞来昔布组与模型组对比,下降趋势不显著,差异PLX4032溶解度无统计学意义(P>0.05),而针刺组较塞来昔布组关节肿胀评分虽有一定下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。(2)血清IL-17、血清IL-23:相对于空白对照组,经造模后,其余各组小鼠血清中IL-23、IL-17表达显著升高,差异具有高度统计学意义(P=0.000<0.01),表明小鼠经免疫造模后血清IL-23、IL-17炎症因子表达水平升高,证明PGIA小鼠模型中存在IL-23/Th-17炎症轴失衡。经治疗后,与模型组相比,针刺组和塞来昔布组PGIA小鼠血清中IL-23、IL-17表达水平趋势均显著降低,其差异具有高度统计学意义(P<0.01)。治疗后,针刺组小鼠血清IL-23水平表达与塞来昔布组血清中IL-23相比无统计学差异(P>0.05),表明针刺和塞来昔布对于抑制血清IL-23表达无明显差别;针刺组小鼠血清IL-17较塞来昔布组小鼠血清IL-17水平表达显著降低,其差异具有高度统计学意义(P<0.01),表明针刺较塞来昔布药物对PGIA小鼠血清IL-17抑制更显著,针刺能有效调节IL-23/Th-17炎症轴,抑制炎症因子进而抑制和降低了炎症反应。(3)血清TNF-α:造模后,与空白对照组对比,PGIA小鼠血清中TNF-α表达水平具有高度统计学差异(P=0.000<0.01),说明PGIA小鼠中存在炎症因子失衡;经治疗后,与模型组相比,针刺组与塞来昔布组TNF-α表达水平均降低,其中塞来昔布组血清中TNF-α表达水平降低趋势具有统计学差异(P=0.018<0.05),针刺组血清TNF-α表达水平显著降低,差异具有高度统计学意义(P=0.000<0.01)。针刺组与塞来昔布组对比,差异具有高度统计学意义(P<0.01),表明针刺可抑制TNF-α水平表达及降低炎症因子而发挥作用,并且针刺较塞来昔布组降低TNF-α水平效果显著。(4)骶髂,后爪关节HE染色病理组织切片:经过HE染色发现骶髂关节间隙变窄,骶髂及其周围组织大量炎症细胞浸润,骶髂关节边缘软骨分布不均匀并且后爪部也出现不同程度的炎性细胞浸润,表明PGIA小鼠模型构建成功。经治疗后,塞来昔布组、针刺组较模型组骶髂关节及后爪受累LXH254说明书情况均有所改善,骶髂关节间隙稍改善,骶髂关节边缘软骨分布排列较模型组较规整,骶髂及后爪部炎性细胞浸润减少,但仍有些许炎性细胞浸润。从HE染色图片看出,针刺组较塞来昔布组对骶髂及后爪炎细胞侵袭程度明显减轻,表明了针刺组在改善骶髂、后爪关节炎等方面优于塞来昔布组。结论1.针刺能有效改善AS患者肢体关节运动功能及脊柱活动度(如腰部侧弯、腰部弯曲、颈部旋转程度、下蹲、站立及胸廓呼吸等功能活动度等),防止、延缓关节僵硬变形,降低致残率,其作用机制可能与针刺具有抗炎、调节炎症因子水平作用有关。2.本研究结果表明BALB/c小鼠诱导的AS模型(PGIA小鼠模型)构建成功,PGIA小鼠体内存在IL-23/Th17炎症轴的失衡。针刺可通过调控IL-23/Th17轴中TNF-α、IL-17、IL-23炎症因子的表达水平,改善骶髂,后爪关节炎症淋巴细胞的浸润、修复关节面骨质的破坏发挥抗炎、免疫调节的作用,这可能是针刺治疗AS的作用机制之一。