在兽医临床上多种动物疾病都伴随着炎症的发生,过度的炎症反应会对机体造成严重损害,临床上常应用合成抗炎药治疗炎症。但常用合成抗炎药物的严重不良反应及在畜禽体内残留问题已对畜牧养殖业构成严重威胁,限制其在临床上的应用。天然药物由于其活性较强、多靶点和低毒副作用等成为目前抗炎药物研发的主要来源。南非醉茄(Withania somnifera)为茄科睡茄属植物,主要有效成分为醉茄内酯类化合物,在抗炎、抗菌、调节免疫等方面具有良好的作用效果,有较好的开发价值和应用前景。但目前其研究主要集中在粗提物上,尤其单体成分的抗炎活性研究尚未见系统报道。本课题组前期采用色谱法与光谱法构建了醉茄内Viral respiratory infection酯类化合物的分子库,体外预试验表明醉茄内酯类衍生物对炎症反应有显著的抑制作用。以COX-2为特异性靶点,运用虚拟对接筛选有COX-2抑制作用的抗炎先导物是当前的研究热点。因此本课题拟从醉茄内酯类分子库中以COX-2为靶点筛选确定抗炎先导化合物,借助体内外炎症模型以及炎症信号传导通路平台,全面系统地研究其抗炎活性及作用机制,以期为醉茄内酯类化合物作为抗炎药物的开发利用提供详实的理论支持。本研究利用分子对接,预测醉茄内酯化合物与COX-2和i NOS蛋白的作用靶点,结合体外酶抑制试验确定抗炎先导化合物—醉茄素A。建立脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7细胞炎症模型,并采用醉茄素A干预,通过MTT法和中性红法分别检测细胞活力和细胞吞噬活性,Griess法检测细胞上清液NO含量,ELISA法检测细胞上清液PGE_2、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-10的含量,考察醉茄素A的体外抗炎活性;采用实时荧光定量PCR法(RT-q PCR)和免疫印迹法(WB)检测细胞中Tselleck NMRLR4、TRAF6、IκB和p65的基因及蛋白表达量,从分子水平揭示醉茄素A的体外抗炎作用机制。建立LPS诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)模型,并采用醉茄素A干预,通过HE染色对肺脏进行组织学分析,同样对肺组织匀浆上清液中NO含量与肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量进行检测,考察醉茄素A的体内抗炎活性;采用RT-q PCR和WB检测小鼠肺组织中TLR4、TRAF6、IκB和p65的基因及蛋白表达水平,揭示醉茄素A体内抗炎作用的分子机制。结果表明,醉茄素A与COX-2和i NOS蛋白存在较强的结合作用,且能显著抑制COX-2酶活性。体外试验结果表明,醉茄素A能通过抑制RAW 264.7细胞增殖和细胞吞噬活性,降低NO、PGE_2、TNF-α和IL-6的含量,升高IL-10的含量,发挥体外抗炎作用;醉茄素A能下调RAW264.7细胞中TLR4和TRAF6的基因和蛋白表达水平,抑制p65和IκB蛋白磷酸化,证明醉茄素A可通过介导TLR4-NF-κB通路发挥体外抗炎作用。体内试验结果表明,醉茄素A能通过降低小鼠肺湿/干重比值,降低NO、TNF-α、IL-1β和IL-6含量,促进IL-10的表达,发挥体内抗炎作用;PS-341分子式醉茄素A能下调小鼠肺组织中TLR4和TRAF6的基因和蛋白表达水平,抑制p65和IκB蛋白磷酸化,揭示醉茄素A可通过介导TLR4-NF-κB通路发挥体内抗炎作用。综上所述,本研究以COX-2为靶点成功筛选出先导化合物—醉茄素A,阐明醉茄素A在体内外炎症模型中均具有显著的抗炎活性,且进一步从TLR4-NF-κB信号通路揭示醉茄素A的抗炎作用的分子机制。本研究为醉茄内酯类作为抗炎药物的开发利用提供理论基础,为具有自主知识产权的新型绿色抗炎药物研发提供新思路。