结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是目前全球范围内致死率第二的消化道恶性肿瘤,其发生发展过程受多重环节调控,但对其驱动性分子事件及机制远未阐明。近年来学界提出肿瘤干细胞是包括结直肠癌在内的肿瘤发生发展的根源,肿瘤干细胞具有自我更新和分化能力,可驱动产生异质性肿瘤群体。结直肠癌干细胞受Wnt、NF-κB、Notch等信号通路的调控,但关键性调控分子以及机制尚未明确,进一步深入研究,可帮助研究者HDAC抑制剂设计靶向结直肠癌干细胞的结直肠癌治疗新策略。此外,较多研究表明,肿瘤相关中性粒细胞可促进或抑制肿瘤的发生发展,但结直肠癌中其作用及机制有待探究。迁移侵袭抑制蛋白MIIP是一新近发现的抑癌基因,已被证明在多种肿瘤中发挥抑癌功能。课题组前期研究表明MIIP缺失促进结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭等行为,同时我们利用MIIP杂合缺失的结肠癌细胞进行转录组测序,提示MIIP负向调控肿瘤干细胞和NF-κB信号途径,并且可参与调控中性粒细胞。因此本研究拟深入探究MIIP在结肠癌发生发展中的作用与机制。目的:1.明确MIIP缺失在结直肠癌发生中的作用;2.分析MIIP对结直肠癌干细胞干性的调控作用;3.研究MIIP对NF-κB信号途径的调控作用;4Z-IETD-FMK分子式.探索MIIP对结直肠癌肿瘤微环境中中性粒细胞浸润的影响。方法:1.使用CRISPR/Cas 9基因编辑技术建立Miip~(flox+/-)小鼠,分别与野生型小鼠、Villin-Cre小鼠杂交后再自交;提取两种基因型小鼠肠道上皮细胞及其余组织RNA,q PCR检测Miip表达水平;正常饲养及使用AOM-DSS法诱导两种基因型小鼠结直肠癌肿瘤,记录其体重曲线,观察肿瘤生成情况,HE染色检测组织形态学改变。2.使用Miip过表达或敲低的慢病毒感染CMT-93细胞,提取细胞系RNA,q PCR鉴定Miip表达水平;使用CMT-93 Miip稳转细胞系进行干细胞成球实验、有限稀释法成瘤实验;Western-blot以及免疫组织化学染色检测小鼠结直肠癌组织中CSC干性标志物和基因。3.通过双荧光素酶报告基因实验、Western blot、免疫组化染色,检测MIIP过表达或敲减对NF-κB信号途径的影响;利用免疫共沉淀实验检测MIIP相互作用分子。4.利用q-PCR、ELISA,检测MIIP过表达或杂合缺失对CXCL-1、CXCL-8表达的影响;HE染色以及免疫组化染色,检测Miip~(ΔIEC)小鼠和对照小鼠结直肠癌组织中中性粒细胞浸润。结果:1.Miip~(flox+/-)小鼠分别与野生型小鼠、Villin-Cre小鼠杂交再自交后获得Miip~(flox/flox)小鼠以及Miip~(flox/flox,p Villin-Cre)(简写Miip~(ΔIEC))小鼠,q-PCR结果显示Miip~(ΔIEC)小鼠仅肠道上皮细胞不表达Miip,说明肠道上皮特异性Miip敲除小鼠构建成功。正常饲养小鼠发现肠上皮Miip特异性敲除对小鼠生长无明显影响,AOM-DSS法诱导后Miip~(ΔIEC)小鼠出现便血,且形成肿瘤数量较对照组更多,HE染色显示Miip~(flox/flox)小鼠多见腺瘤和息肉样改变,偶见低级别上皮内瘤变,而Miip~(ΔIEC)小鼠肿瘤除上述改变外,多见高级别上皮内瘤变和浸润癌。2.q PCR结果显示CMT-93 Miip稳转细胞系构建成功,利用上述细胞进行干细胞成球实验及有限稀释法成瘤实验,结果显示Miip抑制干细胞成球、有限稀释法成瘤,在肠上皮Miip特异性敲除小鼠结直肠癌肿瘤中,干性基因表达增加。3.双荧光素酶报告基因实验以及Western-blot实验,显示Miip过表达抑制NF-κB信号途径,小鼠结直肠癌免疫组织化学染色结果显示Miip敲除促进p65核转位;进一步免疫共沉淀实验显示MIIP与IKKα相互作用。4.q PCR及ELISA结果均显示MIIP抑制趋化因子CXCL-1、CXCL-8的表达;且HE染色以及免疫组化结果显示Miip特异性敲除小鼠结直肠癌肿瘤中中性粒细胞浸润增加。结论:1.Miip~(ΔIEC)较对照小鼠更易被AOM-DSS法诱发小鼠结直肠癌,初步提示Miip缺失促进结直肠癌的发生。2.Miip抑制结直肠癌细胞成球、最小细胞数成瘤以及干性Marker表达,androgen biosynthesis表明Miip抑制结直肠癌CSC特性;3.MIIP抑制NF-κB信号途径且与IKKα存在相互作用,提示MIIP可能通过负向调控IKK/NF-κB信号途径发挥其抑制结直肠癌干细胞干性的作用。4.MIIP抑制招募中性粒细胞的趋化因子表达,且Miip~(ΔIEC)小鼠结直肠癌中性粒细胞浸润增加,提示MIIP缺失可能通过促进趋化因子表达而招募中性粒细胞。