背景脊髓损伤后机体反应机制复杂,如何提高脊髓损伤的治疗效果具有较高的临床价值。脊髓损伤发生后神经细胞死亡,原有的神经信号传递通路遭到破坏,使得冲动电信号无法越过损伤部位传递到另一侧。虽然在损伤发生后机体会产生内源性电场,刺激内源性神经干细胞(neural stem cell,NSCs)selleckchem Lapatinib增殖分化来启动内源性修复机制,但在炎性微环境和氧化应激等不利因素的影响下,机体的内源性修复效果并不明显。电刺激可以通过多种离子通道激活体内信号通路,调节机体内的分子转运和信号转导,对多种组织和器官具有明显的促进修复和再生作用。利用材料和外界刺激来增强损伤局部电刺激的效果可以进一步促进神经信号传递通路的重建,有利于脊髓损伤后的功能恢复。聚乳酸羟基乙酸(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)是一种拥有良好组织相容性和机械性能的高分子化合物,在组织工程中有广泛的应用,但单独应用PLGA并不足以满足脊髓损伤修复的需求。金纳米粒子(Au NPs)作为一种具有良好导电性和生物相容性的金属粒子,能够改善材料的理化性能,提升电刺激的治疗效果。因此,为了最大化提升材料和电刺激联合对脊髓损伤的治疗效果,本研究旨在构建一种负载金纳米粒子的聚多巴胺涂层修饰PLGA多功能复合材料(Au NPs@PDA-PLGA),赋予材料良好的导电能力和生物性能,联合电刺激共同治疗最大化促进脊髓损伤的修复。目的本研究计划构建一种负载金纳米粒子的聚多巴胺涂层修饰PLGA复合材料,并对复合材料的理化性质和生物学特性进行调控使其满足脊髓损伤修复的需求。通过细胞实验验证复合材料联合电刺激对于NSCs增殖的促进作用和NSCs向神经细胞分化的定向调控作用。并将复合材料原位移植到大鼠脊髓损伤部位,联合电刺激促进损伤区域的神经细胞再生和传导通路重建,减少炎细胞浸润和胶质瘢痕形成,实现脊髓损伤后运动和感觉功能的有效恢复。方法1.Au NPs@PDA-PLGA复合材料的制备。利用聚多巴胺(Polydopamine,PDA)的还原性和粘附性构建负载Au NPs的聚多巴胺涂层修饰PLGA复合材料,使用能量色散光谱仪(EDS),X射线衍射仪(XRD)对复合材料的组分构成进行鉴定。通过扫描电镜(SEM),原子力显微镜(AFM),接触角测量仪,四探针电导仪等仪器对Au NPs@PDA-PLGA复合材料的表面形貌,亲水性和导电性等理化性能进行检测。2.Au NPs@PDA-PLGA复合材料的生物性能探究。利用BCA试剂盒,ROS试剂盒分别检测Au NPs@PDA-PLGA复合材料的蛋白吸附能力和活性氧清除能力。将NSCs接种在复合材料表面,通过CCK-8,细胞活死染色评估Au NPs@PDA-PLGA复合材料的LGX818浓度细胞毒性;将Au NPs@PDA-PLGA复合材料植入到动物体内,通过HE染色评估复合材料在植入局部的炎症反应情况和脏器病理学改变情况。3.Au NPs@PDA-PLGA复合材料联合电刺激对NSCs的调控作用。从胎鼠海马中提取NSCs,将NSCs接种在不同材料中培养,使用CCK-8和免疫荧光染色探究NSCs在不同复合材料和电刺激参数下的增殖情况和细胞活性;利用免疫荧光染色探究NSCs在Au NPs@PDA-PLGA复合材料和电刺激作用下的分化情况和神经细胞生长情况;最后通过RT-PCR技术探究Au NPs@PDA-PLGA复合材料和电刺激对于NSCs分化趋势的作用影响。4.Au NPs@PDA-PLGA复合材料联合电刺激对脊髓损伤功能恢复的探究。构建大鼠脊髓全切损伤模型,将复合材料分别植入到损伤处并在术后给予电刺激治疗。通过BBB评分,步态分析和肌电图评估脊髓损伤后运动和感觉功能恢复情况;脊髓组织取材后用HE、LFB染色和透射电镜(TEM)评估脊髓组织恢复和髓鞘再生情况;最后通过免疫荧光染色观察脊髓损伤后神经细胞和髓鞘再生情况,损伤区域炎细胞浸润和胶质瘢痕形成情况,探究Au NPs@PDA-PLGA复合材料联合电刺激治疗促进脊髓损伤修复的潜在机制。结果1.通过EDS和XRD的检测分析,在制备的复合材料中发现了金元素的存在,证明Au NPs被成功接枝在材料表面,成功制备出负载Au NPs的Au NPs@PDAPLGA复合材料。经Au NPs改性的Au NPs@PDA-PLGA复合材料亲水性和导电性与PLGA和PDA-PLGA相比显著提高;在SEM和AFM检测中观察到Au NPs@PDA-PLGA复合材料具有粗糙的表面形貌,有利于细胞的粘附生长和电刺激作用效果的提升。2.细胞活死染色结果显示接种在Au NPs@PDA-PLGA复合材料上的NSCs生长情况良好,植入复合材料的大鼠脏器组织HE染色未见明显病理改变,证明Au NPs@PDA-PLGA复合材料具有良好的生物相容性,为后续细胞实验和动物实验的顺利实施奠定了基础。BCA蛋白吸附实验结果显示PDA能够提高材料的蛋白吸附能力,负载Au NPs能够进一步提高材料的蛋白吸附性能。ROS检测结果显示与PLGA和PDA-PLGA相比,Au NPs@PDA-PLGA能够有效清除活性氧,显著降低细胞活性氧水平。3.Nestin免疫荧光染色证明从胎鼠海马中成功提取了NSCs。细胞增殖实验结果显示生长在Au NPs@PDA-PLGA复合材料表面的NSCs和在电刺激干预下的NSCs活性明显提高,增殖能力明显增强,同时将Au NPs@PDA-PLGA和电刺激联合应用能够进一步促进NSCs的增殖。免疫荧光染色和RT-PCR结果显示Au NPs@PDA-PLGA联合电刺激能够定向调控NSCs分化,促进NSCs向神经细胞分化,抑制NSCs向星形胶质细胞分化;二者联合能够促进神经细胞轴突生长,加速细胞间联系的建立。4.通过构建大鼠脊髓损伤模型并予以相应治疗,我们发现Au NPs@PDAPLGA联合电刺激能够显著改善大鼠后肢运动功能,后肢步态足迹与术前最为接近。肌电图结果显示Au NPs@PDA-PLGA联合电刺激能够缩短神经电信号传导的潜伏期,提高振幅。脊髓HE,LFB和TEM染色结果显示Au NPs@PDA-PLGA联合电刺激能够明显促进损伤区域组织再生和髓鞘生长。免疫荧光染色结果显示复合材料和电刺激联合治疗能够显著促进损伤区域神经细胞的再生和轴突的生长,抑制炎细胞浸润和胶质瘢痕的聚集,促进脊髓损伤的功能恢复。结论本研究课题成功构建了具有亲水性,导电性和粗糙表面结构的Au NPs@PDA-PLGA复合材料。这种复合材料能够有效清除活性氧,促进蛋白吸附,为神经细胞生长营造出适宜的微环境。Au NPs@PDA-PLGA复合材料与电刺激能够发挥协同作用,促进体外NSCs增殖并调控NSCs向神经细胞定向分化,抑制星形胶质细胞的形成。通过大鼠脊髓损伤动物模型证明Au NPs@PDA-PLGA联合电刺激能够促进损伤区域神经细胞的再生和轴突生长,同时减少炎细胞浸润,抑制胶质瘢痕聚集,促进脊髓损伤的运动和感觉功能恢复。这Non-immune hydrops fetalis一创新性的联合治疗手段将为脊髓损伤的治疗提供新的思路。