一、研究背景肝癌是全球第六大常见癌症,致死率居全球癌症的第三位。肝炎病毒感染、黄曲霉毒素和饮用水污染是肝癌的主要致病因素。在治疗方面,临床多以手术切除、肝动脉插管化疗栓塞(Transcatheter arterial chemoembolization,TACE)、全身化疗及射频消融治疗为主。近年来,以索拉非尼为代表的多激酶抑制剂及多种PD-1/PD-L1单抗等免疫检查点抑制剂虽已纳入治疗指南,但治疗效果仍然有限,患者的5年生存率极低。因此,深入探索并进一步明确肝癌的发病机制、寻找特异性治疗靶点,是未来临床研究的重点和难点。肿瘤通过改变代谢途径以满足快速生长、恶性侵袭的能量需求。其中,通过增强己糖胺生物合成途径(Hexosamine biosynthetic pathway,HBP)为自身提供营养已有广泛报道。谷氨酰胺果糖-6-磷酸氨基转移酶-1(Glutamine-fructose-6-phosphate transaminase-1,GFPT-1)是HBP的第一个关键酶,其生物活性通过底物可用性、反馈抑制、磷酸化和转录调节进行调控。研究表明,GFPT-1在乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤中存在异常表达,且与患者的预后相关。但目前,GFPT-1在肝癌中的作用及其临床意义仍不明确,GFPT-1参与调控的分子机制尚未见系统性报道。c-Myc是MYC癌基因家族的主要成员,也是最常激活的致癌基因。c-Myc通过基因扩增或过表达,参与蛋白质翻译、细胞周期调节、细胞凋亡和代谢等,从而发挥促进细胞存活和生长的调控作用。大量研究表明,c-Myc在胰腺癌、胃癌等多种肿瘤中高表达,与患者较低的生存期和临床预后不良显著相关。然而,c-Myc致瘤功能及其下游调控的基因和信号通路仍有待充分研究。更重要的是,c-Myc是否参与肝癌代谢重编程增强HBP,是否参与GFPT-1的表达及转录调控仍尚不明确。二、研究目的本论文旨在研究:(1)检测GFPT-1、c-Myc在原发性肝细胞癌(Hepatocellular c arcinoma,HCC)患者病理样本中的蛋白表达水平;明确GFPT-1和c-Myc的表达与各临床病理参数的相关性以及对患者预后的影响;(2)探究GFPT-1和c-Myc的表达在几种不同肿瘤中对患者总生存期的影响;(3)分析c-Myc与GFPT-1蛋白表达的相关性及临床意义,为寻找肝癌治疗的新型有效分子靶标提供实验数据支持。三、材料与方法1.对6周龄的C57BL/6小鼠采用尾静脉高压注射质粒的方法,建立以下四组小鼠原发性HCC模型,分别是:(1)c-Myc过表达、Trp53敲除组(c-Myc;Trp53);(2)c-Myc、N90-β-catenin过表达组(c-Myc;N90-β-catenin);(3)c-Met、N90-β-catenin过表达组(c-Met;N90-β-catenin);(4)Nras、AKT 过表达组(Nras;AKT)。每组小鼠各有5只,验证模型构建成功后,使用免疫组化技术检测GFPT-1和c-Myc在各组小鼠原发性HCC模型中的表达,探究两者的表达在小鼠HCC中的相关性。2.收集到山东大学齐鲁医院病理科在2018年1月到2018年7月之间诊断为HCC的病例共75例,统计患者临床病理特征并对患者的生存状态进行随访。免疫组化法检测GFPT-1和c-Myc蛋白在HCC中的表达水平,采用χ2检验分析GFPT-1和c-Myc的表达与HCC患者各临床病理参数的相关性。通过Kaplan-Meier法绘制生存曲线,探究GFPT-1和c-Myc的表达对HCC患者总生存期的影响,并依据患者临床病理参数进行分层分析。建立COX单因素及多因素回归模型,分析影响HCC患者预后的风险因素;使用Spearman等级相关分析,检测HCC中GFPT-1和c-Myc蛋白表达的相关性。3.使用Kaplan-Meier Plotter涵盖的数据库信息,评估在HCC、食管腺癌、胰腺导管腺癌等恶性肿瘤中,GFPT-1和c-Myc的表达对患者总生存期的影响。四、研究结果1.免疫组化法检测GFPT-1在四组小鼠原发性HCC中的表达水平,结果显示c-Myc过表达的两组小鼠 HCC 模型(c-Myc;Trp5Apoptosis抑制剂3及c-Myc;N90-β-catenin)中,GFPT-1 均呈阳性表达。而其他两组小鼠HCC模型(c-Met;N90-β-catenin及Nras;AKT)中,GFPT-1均为阴性。Spearman等级相关分析显示,小鼠HCC组织中GFPT-1和c-Myc的表达呈显著正相关。2.与患者癌旁组织相比,GFPT-1蛋白在原发性HCC组织中表达升高,且GFPT-1高表达与患者的性别及肿瘤Edmondson-Steiner分级相关。GFPT-1的表达与患者年龄、肿瘤直径、AFP值、TNM分期及远处转移情况无明显相关性。GFPT-1高表达组中患者总生存期较低表达组显著下降,表明GFPT-1的表达与患者总生存期存在相关性。构建COX比例风险回归模型证实,远处转移及GFPT-1的表达是影响HCC患者总生存期的独立风险因素。使用Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现,在HCC、食管腺癌、胰腺导管腺癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌及肉瘤中,GFPT-1高表达组总生存期均较低表达组短,差异具有统计学意义。3.免疫组化染色结果显示,c-Myc在58.76%的原发性HCC患者中存在过表达,肿瘤组织的表达显著高于癌旁组织。c-Myc蛋白表达仅与肿瘤Edmondson-Steiner分级呈正相关,与患者年龄、肿瘤直径、AFP值等其他临床病理参数不具有相关性。c-Myc高表达的患者总生存期较低表达组短,表明c-Myc的表达与患者总生存期具有相关性。基于Kaplan-Meier Plotter数据库的研究显示,在胰腺导管腺癌、头颈部鳞状细胞癌及肉瘤中,c-Myc高表达组的总生存期均较低表达组短。4.在75例原发性HCC病例中,GFPT-1与c-Myc均高steamed wheat bun表达的有32例,均低表达的有23例。Spearman等级相关分析表明,在人原发性HCC组织中GFPT-1和c-Myc的表达呈显著正相关。与GFPT-1和c-Myc均低表达组相比,两者均高表达的患者总生存期显著降低。五、研究结论通过以上研究,我们得出以MDV3100分子量下结论:1.在小鼠原发性HCC及人原发性HCC组织中,GFPT-1与c-Myc的表达均呈显著正相关,这提示GFPT-1与c-Myc在HCC的发生发展中可能存在协同作用。GFPT-1和c-Myc均高表达的患者总生存期比均低表达组显著降低,联合抑制c-Myc和GFPT-1可能成为HCC治疗的潜在靶点。2.GFPT-1、c-Myc的表达均与HCC的组织学分级呈正相关,提示两者与HCC的恶性程度有关。3.GFPT-1、c-Myc的表达不仅是HCC患者不良预后的影响因素,还降低胰腺导管腺癌、头颈部鳞状细胞癌等癌症患者的总生存期,提示两者可能是影响部分癌症患者预后的危险因素。