解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种公认安全的非常规酵母。由于具有独特的生理特征,目前已被广泛的用于细胞工厂的构建。在解脂耶氏酵母的代谢工程中,筛选标记基因是遗传转化载体所必备的基本元件,构建细胞工厂需要筛选标记来选择具有所需基因修饰的细胞。此外,对代谢途径中的关键基因进行精确修饰也是至关重要的。然而由于解脂耶氏酵母中可用的筛选标记数量少,使得对解脂耶氏酵母的迭代遗传修饰受限于筛选标记的数量。虽然簇状有规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)基因编辑系统由于具备准确、高效的特性,已被广泛的应用于各个物种,但是在解脂耶氏酵母中进行基因编辑时,依然存在Cas9编辑效率低、解脂耶氏酵母同源重组能力差等问题,导致对基因组的精准改造效率较低。因此开发解脂耶氏酵母的筛选标记,以及在解脂耶氏酵母中构建高效的CRISPR基因编辑系统,对实现其迭代基因编辑,构建高效的细胞工厂具有重要意义。本论文首先通过测试不同类型的显性筛选标记以及相应的抗生素等药物的抑制浓度,确定了四种可应用于解脂耶氏酵母的筛选标记。我们首先开发了一种显性筛选标记dsdA,该基因编码D-丝氨酸脱氨酶,可赋予解脂耶氏酵母利用D-丝氨酸作为唯一氮源的能力。另外,我们进一步分析了四个在解脂耶获悉更多氏酵母中不常用的抗性筛选标记及筛选条件,包括发现bleoR(博来霉素抗性基因),kanMX(G418抗性基因)以及guaB(霉酚酸抗性基因)的表达,可以使酵母获得对于相应药物的抗性,但铜离子抗性基因CRF1的表达没有使酵母获得相应的抗性。因此我们成功获得了四种显性筛选标记。其次,我们对CRISPR/Cas9系统的各个元件进行了优化,以实现在解脂耶氏酵母中高效的基因编辑。首先通过非同源末端连接介导的基因敲除来测试Cas9的切割效率。研究发现利用启动子SCR1p-tRNA表达sgRNA,Cas9的基因敲除效率比利用TEFin启动子高37.5%,另外,Cas9整合到基因组YAL11_E15321g位置时,比游离质粒表达Cas9的敲除效率高22.5%。通过Cas9的基因组整合和sgRNA的启动子优化,显著提高了 Cas9的编辑效率,达到92.5%。除此之外,我们利用内源的tRNAGly加工机制,通过串联tRNAGly-sgRNA的方式,构建了双重靶向的基因编辑系统,实现同时敲除TRP1、URA3的效率达到57.5%。在优化切割效率的基础上,为了在解脂耶氏酵母中利用CRISPR实现高效的定点整合,我们对解脂耶氏酵母的DNA内源修复机制进行改造来增强同源重组能力。但是过表达同源重组相关基因RAD52、SAE2并未提高整合效率,通过敲除非同源末端连接关键基因KU70提高了定点整合效率,达到92.5%。然而研究发现,在KU70缺失的基础上,将野生型Cas9利用游离质粒表达其定点整合的效率比整合在基因组上低45%。为进一步提高利用游离质粒表达CRoxadustat IC50as9时的定点整合效率,我们在Cas9中引入D147Y和P411T双点pulmonary medicine突变,使定点整合效率在不敲除KU70的菌株中提高至75%,比野生型Cas9提高了 32.5%,而KU70的敲除并未进一步提高整合效率。本文开发的筛选标记将有助于扩充解脂耶氏酵母的遗传工具库,有利于对解脂耶氏酵母的遗传操作。另外,本研究在解脂耶氏酵母中,通过基因编辑元件及酵母重组系统的改造,构建CRISPR基因编辑系统,实现了高效的基因敲除和定点整合。研究结果对于促进解脂耶氏酵母菌株的工程改造,构建高效的细胞工厂,生产各种各样的化学品具有较好的促进意义。