生产实践中,预防H7N9亚型禽流感病毒的措施通常是疫苗免疫。其中,病毒载体疫苗能够诱导全方位的免疫应答,包括体液免疫、细胞免疫与粘膜免疫,而且不需要佐剂。前期研究发现,包括但不限于以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)载体在内的一系列含有H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组载体疫苗免疫哺乳动物和禽类后诱导机体产生的免疫应答特征如下:高水平的特异性IgG抗体和低水平的HI/VN抗体;高水平的H7N9亚型禽流感病毒攻毒保护率。这一免疫特征无法用目前疫苗的免疫效果评价机制进行充分解释。因此,本研究将从分子层面和免疫学层面两个角度对含有H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的NDV载体疫苗的免疫机制进行阐释,主要分为:免疫优势抗原表位的确定和非中和抗体在免疫过程中发挥作用的主要方式的探索。通过两个维度的探究解释非中和抗体在H7N9亚型禽流感病毒重组载体疫苗的免疫过程中发挥作用的方式和机制。1.H7N9亚型禽流感NDV载体疫苗免疫血清识别的优势抗原表位的鉴定本研究先对H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白载体疫苗免疫血清,空载体免疫血清和商品化灭活苗免疫血清进行分析鉴定,结果显示载体疫苗免疫血清和空载体免疫血清中针对新城疫的HI抗体水平均超出检出限达到32,而相较于商品化灭活苗免疫血清中高达128的HI抗体水平,载体疫苗针对H7N9亚型禽流感病毒的HI抗体水平远低于检测限和商品化灭活苗免疫血清,仅达到4。比较载体疫苗和商品化灭活苗两者诱导产生的针对H7N9亚型禽流感病毒的总抗体水平并无太大差距。在此基础上,建立被动免疫模型评价载体疫苗免疫血清提供的保护效果,对7日龄雏鸡分别注射600μl载体疫苗免疫血清,商品化疫苗免疫血清以及普通血清,注射后1h进行强H7N9亚型禽流感病毒攻毒,连续观察雏鸡存活状态。结果显示:在排除了细胞免疫的干扰后,血清被动免疫模型中无论是含有高水平中和抗体的商品化疫苗血清还是含有低水平中和抗体高水平非中和抗体的载体疫苗免疫血清都能对H7N9亚型禽流感病毒强毒的攻毒产生100%的保护效果。该结果说明,非中和抗体在载体疫苗免疫病毒攻击的过程中不仅有保护效果,而且发挥了非常重要的保护效果。在此基础上,本研究进行非中和抗体Lipid biomarkers识别的优势抗原表位鉴定,通过竞争ELISA的方法,将H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白作为包被抗原,将前期设计的一系列针对HA蛋白不同位点的单抗作为竞争性抗体,和H7N9亚型禽流感病毒载体疫苗免疫血清进行与包被抗原的竞争性结合,通过对比竞争结合率筛选出一株针对HA蛋白G151位点的单抗,竞争结合率高达36.7%。突变该位点后,分别再用突变病毒和原病毒作为包被抗原,用不同浓度的单抗分别与载体疫苗免疫血清进行竞争结合,结果显示,位点突变后,竞争抑制率从原来的30%,下降至不足10%。进而构建相邻位点S150和S152的突变病毒进行ELISA实验,比较和血清的结合率,发现G151,S150和S152三个位点分别单点突变的病毒与亲本毒相比和载体疫苗免疫血清的结合率显著下降。这些结果都表明G151,S150和S152三个位点是载体疫苗诱导产生的抗体针对的优势抗原表位。2.H7N9亚型禽流感免疫血清介导的补体杀伤效应检测方法的建立与靶细胞的构建研究通过构建稳定表达HA蛋白的细胞系模拟病毒感染后的靶细胞,用载体疫苗免疫血清作为抗体和补体的提供方,用检测乳酸脱氢酶(LDH)释放的情况来衡量补体杀伤效应的程度。通过一系列实验,确定优化了检测方法中的系列指标,包括:靶细胞的种属,靶细胞的浓度,以及实验组血清的浓度,最终确定为:293T,0.75×1确认细节04/100μL,以及1:10稀释10μL。同时,用慢病毒包装的方法,将构建好的慢病毒包装质粒Fv115-HA和辅助质粒共转染293T细胞,并在嘌呤霉素的压力下筛选稳定的慢病毒感染的293T细胞株。结果显示,H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白在293T细胞表面稳定高效表达,成功构建出稳定表达HA蛋白的293T细胞系,为后续实验提供基础。3.基于NDV载体的H7N9亚型禽流感疫苗诱导的CDC效应评价研究主要通过检测LDH释放的方式检测免疫血清对于靶细胞的补体杀伤效果,通过间接免疫荧光和测定病毒TCID50的方式检测免疫血清对于病毒粒子的补体杀伤效果。实验分别从热灭活免疫血清对于靶细胞和病毒粒子的补体杀伤效应影响;补体抑制剂聚苯乙醇磺酸钠(SPS)处理血清后对于靶细胞和病毒粒子的补体杀伤效应影响;以及免疫血清对于抗原优势表位发生突变的病毒及其感染细胞的补体杀伤效应三个方面探究含H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的载体疫苗免疫血清的保护机制。最终结果显示:血清中补体和抗体同时存在时,对于靶细胞和病毒粒子的补体杀伤效应最显著;补体或者抗体只存在一个时,免疫血清对于感染细胞和病毒粒子的杀伤效果大大下降;将H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白上的免疫CP-456773血清识别的优势抗原表位进行突变后,发现补体杀伤效果基本消失。