类风湿关节炎(RA)是一种系统性的自身免疫性疾病,主要累积关节滑膜。由于体内长期处于炎症环境,RA患者还会出现多器官的受累。肺间质性病变(ILD)是RA最为常见的肺部表现和死亡原因之一,约60%的RA患者在RA确诊后5年内表现出明显的间质性肺损伤,且肺损伤严重程度与RA进展呈明显的正相关。目前,针对ILD的免疫发病机制存在两种假说:一种假说基于大多数RA患者关节症状先于肺疾病发生的事实之上,认为ILD起源于滑膜组织损伤,关节瓜氨酸蛋白的免疫反应在肺部中出现了类似的抗原交叉反应;而另一种假说认为类风湿关节炎相关的间质性肺疾病(RA-ILD)初始事件来源于一个或多个粘膜部位,肺中针对瓜氨酸肽的免疫级联反应会“迁移”到关节,从而累及滑膜。虽然这种假说未得到证实,但是可能解释临床上约有20%的RA患者肺部症状先于关节症状发生。内皮细胞(ECs)在血液和组织间质之间所形成的半渗透性屏障有助于维持机体内稳态。ECs的损伤导致屏障完整性的破坏,血管通透性增加,从而促进了炎性细胞的浸润。大量浸润的炎性细胞分泌多种炎性介质和细胞因子,加重ECs损伤。血管紧张素Ⅱ通过与血管紧张素Ⅱ2型受体(Agtr2)结合可以产生拮抗其与Agtr1结合所产生的作用,从而发挥抗炎等生理功能。课题组前期研究发现Agtr2在自身免疫性疾病如RA中起到了重要作用,给予Agtr2激动剂CGP42112后,明显缓解了佐剂诱导的类风湿关节炎大鼠的滑膜炎。而且,Agtr2的活化显著促进滑膜M1型巨噬细胞向M2型的极化过程,进而缓解关节炎的进展。除此之外,Agtr2对肺损伤具有保护作用。Agtr2在正常肺组织中低水平表达,在炎症和损伤中反应性升高,明显缓解慢性阻塞性肺病中的炎症,抑制特发性肺纤维化的发展,改善肺动脉高压的症状。因此,Agtr2在RA-ILD中的作用是值得我们去深入研究。目的:1.探讨RA-ILD的潜在病理机制。2.明确Agtr2的活化是否可以缓解胶原诱导关节炎(CIA)的肺损伤。3.探讨Agtr2缓解CIA-肺损伤的作用机制。方法:1.在第0天和第21天分别注射由完全和不完全弗氏佐剂配置的Ⅱ型胶原乳(1mg/ml)诱导CIA模型。从第一次免疫后的第28天开始,对小鼠进行关节炎指数评分,根据小鼠关节炎发展的严重程度,将造模小鼠分为两组:高峰期(第42天)和缓解期(第56天)。分别在第42天和第56天处死小鼠并收集肺组织进行相关检测:苏木精-伊红(H&E)染色观察肺病理;q PCR检测肺组织中类风湿因子(RF)、肺损伤标志物(KL-6和SP-D)、炎性(IL-1β、TNF-α、Arg-1和Ym-1)以及ECs损伤(ICAM-1和VCAM-1)相关标志物水平;ELISA法检测肺组织中抗CCP抗体滴度;免疫荧光和流式细胞术检测肺组织中ECs和单核细胞变化;流式细胞术检测Ly6C在肺组织单核细胞中表达水平的改变;Western Bolt检测肺组织中Agtr2蛋白水平。2.根据CX3CR1的荧光强度使用流式细胞分选仪对CX3CR1~(lo)(Ly6C~(hi))和CX3CR1~(hi)(Ly6C~(lo))单核细胞进行分选;q PCR检测Ly6C~(hi)和Ly6C~(lo)单核细胞中炎症标记物的基因表达;免疫荧光检测Ly6C~(hi)和Ly6C~(lo)单核细胞中i NOS、CD206以及Agtr2的表达。3.使用LPS预处理的小鼠内皮C166细胞体外模拟受损的ECs,Transwell检测空白对照和LPS刺激下C166细胞对单核细胞的迁移能力的影响;使用活细胞工作站检测分选单核细胞与预刺激的C166细胞共定位情况;CCK-8、血管生成试验和q PCR分别检测Ly6C~(hi)和Ly6C~(lo)单核细胞对C166细胞的增殖能力、管形成能力和表面粘附分子表达的影响。4.使用Agtr2激动剂C21(10~(-6)M)预处理C166细胞,Transwell检测活化Agtr2后C166细胞对单核细胞迁移能力的影响;CCK-8、血管生成试验和q PCR分别检测活化Agtr2后C166细胞的增殖能力、管形成能力和表面粘附分子的表达。给予分选的Ly6C~(hi)单核细胞C21(10pathologic outcomes~(-6)M)预处理,流式细胞术检测单核细胞中Ly6C的表达变化。5.从第28天开始,每2-3天通过腹腔注射给予CIA小鼠C21(0.3 mg/kg),直至第42天。第42天处死小鼠并取肺组织。H&E染色观察肺病理改变;q PCR检测肺组织中类风湿因子(RF)、肺损伤(KL-6和SP-D)、炎性(IL-1β、TNF-α、APF-03084014临床试验rg-1和Ym-1)以及ECs损伤(ICAM-1和VCAM-1)相关标志物水平;ELISA检测肺组织中抗CCP抗体滴度;流式细胞术检测肺组织ECs数量变化以及单核细胞上Ly6C的表达。结果:1.随着关节炎的进展,CIA小鼠出现明显的肺损伤,表现为间质增厚,炎症细胞浸润,部分小鼠肺中淋巴滤泡形成。在关节炎高峰期(第42天),ECs数量明显减少,血管腔内CD31表达明显降低,内皮完整性受损。同时,单核细胞数量增加,主要为促炎表型的Ly6C~(hi)单核细胞;而在关节炎缓解期(第56天),ECs数量逐渐增加,CD31表达升高,浸润单核细胞减少,且具有抗炎表型的Ly6C~(lo)单核细胞比例增加。2.与Ly6C~(hi)单核细胞相比,Ly6C~(lo)单核细胞高表达Agtr2、CD206、Ym-1以及Arg-1;而Ly6C~(hi)单核细胞表达较高的i NOS、IL-1β和TNF-α。3.C166细胞受损后大量募集单核细胞。与Ly6C~(hi)单核细胞相比,Ly6C~(lo)单核细胞更倾向于聚集在受损的ECs周围,可能与ECs增殖和血管管形成相关,并参与了降低粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表达。4.C21激活Agtr2后,受损C166细胞的增殖能力和管形成能力增强,粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表达降低,浸润的单核细胞数量明显下降。C21明显促进了Ly6C~(hi)单核细胞向Ly6C~(lo)单核细胞转化。5.给予CIA小鼠C21治疗后,小鼠肺部炎症明显缓解,ECs数量增加,Ly6C~(hi)/Ly6C~(lo)单核细胞比例降低。结论:1.CIA小鼠的肺损伤与ECs的损伤和单核细胞浸润相关。2.Agtr2的活化缓解了CIA小确认细节鼠的肺损伤可能是通过减轻ECs损伤和促进Ly6C~(hi)向Ly6C~(lo)单核细胞转化相关。3.Agtr2可能是RA-ILD新药开发以及治疗的一个新靶点。