背景:手术切除与以顺铂为基础的化疗仍然是治疗卵巢癌的主要方法。但顺铂等铂类药物还面临着毒副作用与治疗效果不佳等诸多问题。研究者们期待通过将不同致癌途径的抑制剂联合应用,通过提高顺铂等化疗药物的抗肿瘤活性来增加临床治疗卵巢癌的效果。但是相对于单一抗肿瘤药物作用机制,联合治疗肿瘤的机制仍然知之甚少,进一步研究与探讨药物联合治疗的作用机制,能够为卵巢癌的临床治疗提供新的线索。细胞蛋白质稳态由2个高度保守的降解途径即泛素-蛋白酶体系统(UPS,Ubiquitin-proteasome system)和巨自噬/自噬调节维持。蛋白酶体通过调节蛋白的降解,在维持蛋白质稳态、促进细胞存活等方面中发挥关键作用。研究者们已经发现MG132等蛋白酶体抑制剂能够减少抑癌蛋白p53降解从而诱导细胞凋亡。而顺铂通过损伤细胞DNA同样可以诱导p53蛋白的表达,提示将蛋白酶体抑制剂与顺铂联合应用可能会产生更有效的抗肿瘤效果。最近还有研究发现,抑制蛋白酶体不仅会引发蛋白质毒性,还会导致线粒体功能障碍。因此Integrative Aspects of Cell Biology,以线粒体功能障碍为切入点,可能深入阐明p53在抑制蛋白酶体诱导细胞凋亡中的作用。UPS或自噬通过泛素链降解未折叠或错误折叠蛋白质的聚集,这两者之间存在相互代偿作用。当蛋白酶体受到抑制时,如果自噬流通畅,则可以发挥代偿作用促进细胞存活;反之,自噬流受阻时会加重细胞异常蛋白聚集,导致细胞死亡。具有泛素结合结构域(Ubiquitin-associated domain,UBA)的自噬相关蛋白p62通过其UBA结构域可与多泛素化蛋白结合形成蛋白聚集体,所以p62被认为是UPS和自噬之间非常重要的信号通信节点。课题组前期研究工作发现,抑制自噬堆积的p62能形成死亡平台通过募集Caspase-8促进肿瘤细胞凋亡。研究者们发现p53线粒体易位可以导致细胞凋亡,定位于线粒体的p53被认为可能是抑制肿瘤细胞更有效的作用模式之一。因此,我们推测蛋白酶体抑制剂Epox与顺铂联合可能通过p62影响p53线粒体易位,导致线粒体功能障碍,从而诱导卵巢癌细胞凋亡。细胞核-线粒体之间对话是决定细胞命运的关键。最近研究发现,ATF5作为一种转录因子,通过参与调控线粒体基质HSP10、HSP60、HSP70及CLPP、YMEL1、LONP1蛋白酶及抗凋亡蛋白等的表达,介导线粒体未折叠蛋白质反应(Mitochondrial-unfolded protein response,UPRmt),来协调细胞核-线粒体之Z-IETD-FMK体外间对话,促进细胞生存。因此ATF5在肿瘤发生发展与药物治疗中的作用受到了关注。虽然有文献报道抑制蛋白酶体能够诱导UPRmt,但是ATF5介导的UPRmt与肿瘤细胞顺铂敏感性的关系尚不清楚。以上研究结果提示,通过探讨靶向ATF5介导的UPRmt抑制卵巢癌细胞生存的机制,可能为阐明蛋白酶体抑制剂与化疗药物联合诱导卵巢癌细胞凋亡的机制提供理论依据。本学位论文以生物信息学分析结果作为基础,以上皮性卵巢癌细胞系为研究对象,首先探讨选择性蛋白酶体抑制剂Epox对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响及线粒体p53表达的作用;再利用p62功能性结构域突变技术,确定p62的UBA与LIR结构域突变对线粒体p53表达的影响;最后结合细胞核编码蛋白表达的变化及临床卵巢癌患者病理组织染色结果,从ATF5介导的UPRmt角度阐明Epox联合顺铂通过细胞核—线粒体交叉对话干扰线粒体功能,从而诱导卵巢癌细胞凋亡的机制,旨在为临床卵巢癌的药物联合治疗提供理论与实验依据。研究方法:1.卵巢癌组织芯片差异基因表达的分析利用GEO数据库中GSE9891芯片,对不同卵巢癌组织进行差异表达基因的分析:(1)对不同卵巢癌组织差异表达基因进行GO富集分析。(2)对不同卵巢癌组织差异表达基因进行KEGG分析。2.顺铂对p53蛋白表达的影响及Epox联合顺铂对细胞活力、线粒体功能的影响(1)顺铂对卵巢癌细胞p53蛋白表达的影响及Epox对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响:(1)利用不同剂量顺铂处理A2780细胞和SKOV3细胞24h,MTT法检测细胞活力;用2μg/m L顺铂分别处理2种细胞3h、6h、12h和24h,Western blot法检测2种细胞中p53的表达,以明确p53在顺铂敏感性不同的卵巢癌细胞中的表达差异。(2)利用不同剂量的顺铂单独或和Epox联合处理A2780细胞和SKOV3细胞24h,MTT法检测细胞活力。(2)Epox联合顺铂对线粒体功能及p53对OXPHOS复合体亚基表达的影响:(1)100n M Epox和2μg/m L顺铂单独或联合处理A2780细胞,JC-1染色后流式细胞术检测线粒体膜电势;ATP检测试剂盒检测细胞ATP水平;RT-q PCR检测mt DNA拷贝数。(2)分离线粒体蛋白,Western blot检测POLRMT和OXPHOS复合体蛋白的表达;RT-q PCR检测mt DNA编码的OXPHOS复合体亚基的m RNA水平。(3)将wt-p53质粒转染至A2780细胞,RT-q PCR检测OXPHOS复合体亚基的m RNA表达水平。3.p62通过UBA结构域影响p53线粒体易位导致线粒体功能障碍(1)Epox和顺铂单独或联合对p62和p53亚细胞定位的影响:(1)利用100n M Epox和2μg/m L顺铂单独或联合处理A2780细胞12h,分离细胞核及细胞浆蛋白,Western blot法检测p62和p53的表达。(2)Epox和顺铂单独或联合处理A2780细胞12h,分离线粒体和细胞浆蛋白,Western blot法检测p62和p53的表达。(3)免疫荧光法检测p53和p62与细胞线粒体的共定位情况。(2)Epox和顺铂单独或联合对自噬流及p53和p62蛋白聚集状态的影响:(1)利用100n M Epox和2μg/m L顺铂单独或联合处理A2780细胞12h,加入自噬特异性抑制剂氯喹,Western blot法检测自噬蛋白LC3、p62以及泛素蛋白表达,评价自噬流是否通畅。(2)利用Epox与顺铂单独或联合处理A2780细胞12h,利用1%Triton-SDS对蛋白进行分离,Western blot法检测蛋白的可溶成分与不可溶成分中的p62和p53表达,以确认p53和p62的蛋白聚集状态。(3)p62蛋白的UBA与LIR结构域对线粒体p53和OXPHOS复合体表达及对顺铂敏感性的影响:(1)构建野生型p62(wt-p62)、UBA结构域截短突变的p62(ΔUBA)以及LIR结构域截短突变的p62(ΔLIR),转染A2780细胞,2μg/m L顺铂处理12h,分离线粒体蛋白,Western blot检测线粒体p53的表达。(2)将wt-p62、p62(ΔUBA)以及p62(ΔLIR)转染A2780细胞,2μg/m L顺铂处理A2780细胞12h,用RT-q PCR检测13个OXPHOS复合体亚基的m RNA表达。(3)将wt-p62、p62(ΔUBA)转染A2780细胞,2μg/m L顺铂处理细胞24h,MTT法检测细胞活力;利用100n M Epox和2Laduviglusib供应商μg/m L顺铂单独或联合处理转染了p62(ΔUBA)的A2780细胞12h,Western blot检测线粒体p53的表达。4.Epox联合顺铂抑制ATF5介导的UPRmt诱导A2780细胞凋亡的机制(1)Epox联合顺铂对A2780细胞线粒体ATF5及凋亡相关蛋白表达的影响:利用100n M Epox和2μg/m L顺铂单独或联合处理A2780细胞12h,分离线粒体以及胞浆蛋白,Western blot法检测UPRmt关键蛋白ATF5以及其下游凋亡相关蛋白BCL-2、MCL-1、BAX的表达,以明确ATF5介导的UPRmt的变化与Epox联合顺铂诱导细胞凋亡的作用。(2)Epox联合顺铂对A2780细胞ATF5转录活性的影响:(1)分离细胞核以及胞浆蛋白,Western blot法检测ATF5在细胞核的表达。(2)RT-q PCR检测ATF5介导的UPRmt下游LONP1,HSP10,HSP60以及mt HSP70的m RNA水平,评价Epox联合顺铂对ATF5转录活性的影响。(3)人卵巢癌组织中COXIV、p53、HSP60、YME1L1、ATF5表达的检测:用HE染色、免疫组织化学和免疫荧光染色检测卵巢癌组织中线粒体含量、ATF5、p53、HSP60、YME1L1蛋白表达,验证线粒体及相关调控蛋白与肿瘤恶性潜能的关系。研究结果:1.卵巢癌组织芯片差异基因表达的分析(1)GO富集分析结果显示:差异表达基因主要富集在泛素样蛋白连接酶结合活性、DNA复制的调控、泛素-蛋白转移酶活性等生物学过程。(2)KEGG信号通路分析结果显示:差异表达基因主要富集在蛋白消化和降解通路、p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、Foxo信号通路、细胞周期等信号通路。2.顺铂对p53蛋白表达的影响及Epox联合顺铂对细胞活力、线粒体功能的影响(1)顺铂对卵巢癌细胞p53蛋白表达的影响及Epox对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响:(1)MTT结果显示,与SKOV3细胞相比,相同剂量的顺铂能明显降低A2780细胞的细胞活力;Western blot结果显示,在相同剂量的顺铂作用下,A2780细胞p53的表达随顺铂作用时间延长逐渐增加,而SKOV3细胞的p53蛋白表达水平未见明显变化。提示卵巢癌细胞的顺铂敏感性与p53的表达有关。(2)MTT结果显示,与SKOV3细胞相比,Epox联合顺铂能够对明显降低A2780细胞的细胞活力,提示Epox能够明显增加A2780细胞的顺铂敏感性。(2)Epox联合顺铂对线粒体功能及p53对OXPHOS复合体亚基表达的影响:(1)线粒体功能检测结果显示,Epox联合顺铂联合导致A2780细胞线粒体膜电势明显下降、ATP水平降低及mt DNA拷贝数下降。提示,线粒体功能障碍与抑制蛋白酶体增加顺铂敏感性有关。Epox处理时,ATP水平降低,由mt DNA编码的OXPHOS复合体亚基的m RNA表达有升高趋势。提示OXPHOS生物合成可能是卵巢癌细胞存活的代偿机制之一。(2)Epox联合顺铂导致线粒体RNA聚合酶POLRMT、OXPHOS复合体亚基以及mt DNA编码的OXPHOS复合体亚基的m RNA表达均降低,提示Epox联合顺铂导致mt DNA转录功能受损。(3)在A2780细胞中过表达野生型p53后,RT-q PCR结果显示,大部分由mt DNA编码的OXPHOS复合体亚基m RNA表达明显下降。提示,Epox联合顺铂通过抑制A2780细胞OXPHOS生物合成引起线粒体功能障碍,这可能与p53有关。3.p62通过UBA结构域影响p53线粒体易位导致线粒体功能障碍(1)Epox和顺铂单独或联合对p62和p53亚细胞定位的影响:(1)Western blot结果显示,与Epox组或顺铂组相比,Epox和顺铂联合组中p53的细胞核表达没有明显改变,提示细胞核表达的p53可能并不是Epox与顺铂联合诱导卵巢癌细胞凋亡的主要原因。(2)Western blot结果显示,与Epox组或顺铂组相比,Epox和顺铂联合组中p53的线粒体表达明显增加;与顺铂组相比,Epox和顺铂合加组中的p62的线粒体表达也明显增加,提示线粒体表达的p53可能是Epox与顺铂联合诱导卵巢癌细胞凋亡的主要原因。(3)细胞免疫荧光结果显示,Epox联合顺铂能够分别增加p53和p62与线粒体的共定位。提示,Epox联合顺铂增加线粒体中p53和p62的定位。(2)Epox和顺铂单独或联合对自噬流及p53和p62蛋白聚集状态的影响:(1)Epox单独处理组加入氯喹抑制自噬,结果显示,LC3、p62以及泛素化蛋白的表达明显增加。提示,Epox能够增加A2780细胞的自噬水平,且自噬流量通畅;Epox联合顺铂处理组加入氯喹时,LC3与p62的表达均下调,提示,Epox联合顺铂可能导致A2780细胞自噬流量受阻。(2)Western blot结果显示,Epox能够增加不可溶蛋白中p53和p62蛋白的表达,同时泛素化蛋白总体水平增加。提示Epox可能通过导致异常蛋白堆积从而影响p53的亚细胞定位。(3)p62蛋白的UBA与LIR结构域对线粒体p53和OXPHOS复合体表达及对顺铂敏感性的影响:(1)Western blot结果显示,与野生型p62相比,顺铂处理下A2780细胞p62蛋白UBA以及LIR结构域突变,明显下调p53的线粒体表达。提示p62的UBA结构域和LIR结构域可能参与调控p53在线粒体的表达。(2)RT-q PCR检测结果显示,p62蛋白UBA结构域突变上调OXPHOS复合体亚基m RNA表达,而p62蛋白LIR结构域突变则不能上调OXPHOS复合体亚基m RNA水平。提示p62的UBA结构域可能参与调控了卵巢癌A2780细胞mt DNA编码OXPHOS复合体亚基m RNA的表达,而LIR结构域则作用较弱。(3)MTT结果显示,p62蛋白UBA结构域突变导致A2780细胞的顺铂的敏感性降低。Western blot结果显示,Epox组与Epox和顺铂合加组之间p53的表达含量无显著性差异,在转染了UBA结构域截短突变体后,Epox和顺铂联合作用并不能使p53在线粒体上的表达明显高于Epox组,进一步证明p62的UBA结构域可能参与了p53线粒体易位的调控。4.Epox联合顺铂抑制ATF5介导的UPRmt诱导A2780细胞凋亡的机制(1)Epox联合顺铂对A2780细胞线粒体ATF5及凋亡相关蛋白表达的影响:Western blot结果显示,Epox与顺铂联合处理A2780细胞抑制ATF5及抗凋亡蛋白BCL-2和MCL-1的线粒体表达,增加BAX/BCL-2比值。提示,Epox联合顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡可能与线粒体ATF5表达下降有关。(2)Epox联合顺铂对A2780细胞ATF5转录活性的影响:(1)Western blot结果显示,与Epox组相比,Epox与顺铂联合处理组的ATF5在A2780细胞核的表达有一定程度的下调。提示Epox联合顺铂能够抑制ATF5进入细胞核。(2)RT-q PCR检测结果显示,与对照组相比,Epox组和Epox和顺铂合加组的ATF5下游调控的UPRmt相关基因LONP1,HSP10,HSP60以及mt HPS70的m RNA表达上调;但与Epox组相比,Epox与顺铂联合处理组的LONP1、HSP10、HSP60以及mt HSP70的m RNA表达下调。以上结果提示,Epox联合顺铂通过干扰ATF5介导的UPRmt来干扰线粒体-细胞核交叉对话,从而干扰了线粒体质量控制,抑制OXPHOS生物合成,导致线粒体功能障碍,抑制了UPRmt介导的细胞促存活作用,诱导细胞凋亡。(3)人卵巢癌组织中COXIV、p53、HSP60、YME1L1、ATF5表达的检测:卵巢癌组织中线粒体含量分析显示,癌组织的线粒体含量高于癌旁组织,表明卵巢癌细胞需要提高线粒体含量以维持自身代谢和增殖等的需要;免疫组织化学染色和免疫荧光染色结果显示,在卵巢癌组织中ATF5、p53、HSP60及YME1L1的表达明显高于癌旁组织,且主要位于线粒体。提示ATF5介导的UPRmt与卵巢癌的恶性潜能有关。结论:1.卵巢癌的顺铂敏感性与p53蛋白的表达有关,Epox能够明显增加卵巢癌A2780细胞顺铂的敏感性。2.p62介导的p53线粒体易位通过影响线粒体RNA聚合酶POLRMT和线粒体mt DNA编码OXPHOS复合体亚基的表达,导致线粒体功能障碍,可能是Epox增加顺铂敏感性的主要原因。3.Eopx联合顺铂诱导细胞核与线粒体p62蛋白等蛋白聚集,堆积的p62蛋白通过UBA结构域促进蛋白聚集,在诱导卵巢癌细胞凋亡过程中发挥了关键“桥梁”作用。4.Epox联合顺铂通过干扰ATF5介导的线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)导致异常蛋白聚集,加重线粒体功能紊乱。