实验目的:1.通过网络药理学筛选蒙药姜黄的姜黄素类活性成分对急性早幼粒白血病作用的免疫调节相关的基因靶点与信号通路。2.探究蒙药姜黄的三种姜黄素类活性成份的联合给药对急性早幼粒白血病模型小鼠的作用及药效。3.研究蒙药姜黄的主要活性成分通过免疫调节实现抑制肿瘤,而治疗人急性早幼粒白血病(APL)的影响。实验方法:1.利用Pub Chem,Swisstargetprediction,Pharm Mapper,SEA,Uniport等数据库筛选三种姜黄素的有效成分靶点。通过GEO,Gene Card,OMIM以上数据库获取APL疾病靶点。利用Venny数据库得到三种姜黄素与APL的交集基因。将找到的交集靶点导入Cytoscape3.7.2构建建活性成分-靶点-信号通路相互作用网络,再利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析,将找到的交集靶点导入构建活性成分-靶点-信号通路相互作用网络。最后将三种姜黄素和急性早幼粒细胞白血病(APL)的共同靶点,采用Metascape平台进行GO(gene ontology)功能分析和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)信号通路富集分析。2.将72只雄性NOD/SCID小鼠按随机分为9组,分别是正常对照组,模型组,给药组,阳性对照组,每组均为8只。除了空白组,每组小鼠分别尾静脉注射人早幼粒白血病HL-60细胞5×10~6/0.2m L每一只,接种当日,将培养的细胞进行计数,调节细胞浓度,各组小鼠均接种0.2ml细胞悬液,接种4周之后,眼眶采血,血液分析仪检测,模型小鼠外周血中白细胞数目,淋巴细胞和血小板,中性粒细胞计数占比,并且使用流式细胞术检测各组小鼠血清CD33阳性表达率的变化情况,检测是否造模成功,并观察肿瘤生长情况,正常对照组每只尾静脉注射相同体积的0.2ml羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。自造模成功之后的第2天起每日分别予正常组:CMC-Na,给药组:姜黄素Cur,去甲氧基姜黄素DMC,双去甲氧基姜黄素BDMC,CUR:DMC:BDMC=1:1:1(联合给药组),CUR:DMC:BDMC=12:4:1(联合给药组),姜黄水提物,分别以100 mg/kg灌胃,阳性对照组:环磷酰胺0.1～0.3ml/10g,每只灌胃14d,模型组:CMC-Na。每日观察各组小鼠的活动变化情况。给完药摘取小鼠眼球,采集小鼠的血、脾脏及肝脏组织标本备检;(HE)染色观察脾脏以及肝脏的肿瘤形态学变化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量测定法检测各组小鼠血清中的TNF-a(肿瘤坏死因子-α),MMP2(基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达,通过判断这些细胞因子在各组中的变化趋势来分析蒙药姜黄的主要活性成分对急性早幼粒细胞白血病抗肿瘤作用。3.采用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测,小鼠肿瘤组织肝脏与脾脏的MAPK8(JNK)和STAT3蛋白表达水平;用荧光定量PCR法(RT-PCR)检测小鼠肿瘤组织肝脏与脾脏中的MAPK8(JNK)和STAT3的mRNA表达水平。实验结果:1.通过网络药理学分析得到31个三种姜黄素-APL交集靶点,GO富集分析结果显示972个信号通路,其中包括以炎症、免疫相关因子为主;KEGG通路富集分析发现了59条信号通路,这些信号通路中最显著的是:AGE-RAGE,JAK-STAT和MAPK信号通路作为研究对象,并筛选STAT3,MAPK8(JNK),TNF-a和MMP2为主要研究靶点。分子对接结果显示,三种姜黄素与MAPK8(JNK)核心靶点蛋白均可自发结合,靶点蛋白有着很好的关联性,能够与蛋白形成稳定的复合物,其作用机制可能通过抑制MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路发挥抗肿瘤作用。2.HE染色结果:模型组:组织结构重度异常,组织内可见有大量密而STM2457生产商细小的空泡,可见部分区域坏死,胞核结构消失,细胞间隙内有大量红细胞,细胞间隙可见有大量炎症细胞浸润。给药组:组织结构轻度异常,组织内可见有少量密而细小的空泡,未见明显的肝细胞深染,变性,细胞间隙有少量红细胞浸润,细胞间隙可见有少量炎症细胞浸润,12:4:1组和1:1:1组的效果更明显。通过ELISA检测在各组中对于MMP2和TNF-α水平的测定中得到了一些相同的ELISA统计分析结果,即与空白组相比,APL模型组的MMP2和TNF-α的水平明显增加,证明出现炎症状态。与模型组相比,各药物组的MMP2和TNF-α的水平表达均有不同程度下调(P<0.01,P<0.05),其中联合给药组(12:4:1)和联合给药组(1:1:1)的调控效果最为明显,各药物组和环磷酰胺阳composite genetic effects性组之间的MMP2和TNF-α的水平没有显著差别(P>0.05),增强细胞免疫功能发挥抗肿瘤功效。3.Western blot方法检测各药物组对小鼠肝脏的相关蛋白MAPK8(JNK)和STAT3的蛋白表达的影响。与空白组相比,模型组的MAPK8(JNK)和STAT3的蛋白表达均有不同程度上调(P<0.01,P<0.05)。与模型组相比,CUR组,DMC组,BDMC组,联合给药组(1:1:1)和联合给药组(12:4:1)的MAPK8(JNK)和STAT3的蛋白表达均有不同程度下调(P<0.01,P<0.05),其中联合给药组(12:4:1)和联合给药组(1:1:1)的调控效果最为明显。Western blot方法检测各药物组对小鼠脾脏的相关蛋白MAPK8(JNK)和STAT3的蛋白表达的影响。与空白组相比,模型组的MAPK8(JNK)和STAT3的蛋白表达均有不同程度上调(P<0.01,P<0.05)。与模型组相比,CUR组,DMC组,BDMC组,联合给药组(1:1:1),联合给药组(12:4:1)和姜黄水提物组的MAPK8(JNK)和STAT3的蛋白表达均有不同程度下调(P<0.01,P<0.05),其中联合给药组(12:4:1)和联合给药组(1:1:1)的调控效果最为明显。RT-PCR实验结果显示:本次实验探究了再各实验组刺激下小鼠肝脏的MAPK8(JNK)和STAT3 mRNA的表达改变,与空白组相比,模型组的MAPK8(JNK)和STAT3mRNA的表达均有不同程度上调(P<0.01,P<0.05)。与模型组相比,CUR组,DMC组,BDMC组,联合给药组(1:1:1),联合给药组(12:4:1)和姜黄水提物组的MAPK8(JNK)和STAT3mRNA的表达,均有不同程度下调(P<0.01,P<0.05),其中联合给药组(12:4:1)和联合给药组(1:1:1)的调控效果最为明显。RT-PCR实验结果显示:本次实验探究了再各实验组MS-275刺激下小鼠脾脏的MAPK8(JNK)和STAT3 mRNA的表达改变,与空白组相比,模型组的MAPK8(JNK)和STAT3 mRNA的表达均有不同程度上调(P<0.01,P<0.05)。与模型组相比,CUR组,DMC组,BDMC组,联合给药组(1:1:1),联合给药组(12:4:1)和姜黄水提物组的MAPK8(JNK)和STAT3mRNA表达,均有不同程度下调(P<0.01,P<0.05),其中联合给药组(12:4:1)和联合给药组(1:1:1)的调控效果最为明显,从而提高了抗肿瘤的免疫调节作用。结论:1.三种姜黄素可以不同程度的抑制APL小鼠肿瘤的生长,当三种姜黄素联合用药时,进一步提高了对APL小鼠的抗肿瘤作用。2.姜黄素可以明显抑制APL小鼠肿瘤组织的细胞增殖,明显减少MAPK8(JNK)和STAT3的表达(P<0.05),并能促进肿瘤细胞凋亡。3.证实了三种姜黄素在MAPK信号通路和JAK-STAT通路上对MAPK8(JNK)和STAT3具有抑制作用,并且证明了三种联合姜黄素的抗肿瘤作用要优于单种药物的APL抗肿瘤的效果。