苹果(Malus domestica Borth.)是全球最重要的果树之一,贮藏性是决定苹果果实品质和商品价conservation biocontrol值的重要因素。我国苹果栽培面积和产量均居世界首位,但早、中熟苹果易软化、不耐贮运,影响其食用品质和经济价值。因此,研究调控苹果成熟软化的关键基因及其分子机制,开发出高效的分子标记,对加速耐贮藏苹果遗传改良具有重要的科学意义和应用价值。本研究以不同软化特性苹果果实为试材,通过转录组分GSK1349572体内实验剂量析,筛选到与苹果成熟软化相关的5个候选基因。在此基础上,对候选基因MdPG1(POLYGALACTURONASE1)启动子变异及其上游调控机制进行研究。主要研究结果如下:1、控制苹果软化的关键基因挖掘。通过对60个苹果栽培品种货架期果实乙烯释放量和硬度测定,发现乙烯高峰释放量与果实软化率呈极显著正相关;以‘华红’(较快软化)、‘美八’(较快软化)、‘华硕’(较慢软化)和‘华冠’(较慢软化)果实为试材进行转录组分析,共挖掘到5个参与调控苹果软化过程的候选基因:MdACS3a、MdPG1、CYP707A(MD03G1088100)、MdMADS4和SAUR(MD10G1060800)。2、MdPG1启动子区关键SNP影响MdCBF2调控其表达的分子机制解析。IGV视图显示MdPG1启动子区存在2个SV(Structure Variantion),2个In Del(Insertion/Deletion)和39个SNP(Single Nucleotide Polymorphism)。启动子序列分析发现其中一个SNP(SNP~(C/A))位于ERF顺式作用元件;‘华红’MdPG1等位基因特异性表达分析显示MdPG1转录偏好SNP~A等位基因。通过比较SNP位点不同基因型果实MdPG1表达量和硬度,发现SNP~C与较低的MdPG1表达和较高的果实硬度相关;双荧光素酶和酵母单杂交实验结果表明,与SNP~C相比,AP2/ERF类转录因子MdCBF2极显著增强了SNP~A等位基因对应的MdPG1启动子活性,证明该SNP通过影响MdCBF2对MdPG1表达的激活能力,从而影响果实硬度。基于该位点开发了关联CAPS标记,可望为早期选育具有耐贮藏潜力的苹果种质奠定技术基础。3、MdPG1启动子区lncRNA_(PG1)的鉴定及其作用机制解析。通过对8个苹果品种MdPG1启动子的IGV视图、克隆及测序分析,发现‘美八’、‘华星’、华硕’和‘红脆宝’MdPG1起始密码子上游2,356 bp处存在一段1,335 bp的序列插入,注释为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。其中,‘美八’、‘华星’和‘红脆宝’为单等位基因插入(lncRNA~(+/-)),‘华硕’为双等位基因插入(lncRNA~(+/+))。RNA-seq和q RT-PCR分析表明,该段序列在‘华硕’成熟的果肉组织中能够被转录,利用PCR技术分离到该转录本,命名为lncRNA_(PG1);‘华星’和‘红脆宝’MdPG1等位基因特异性表达分析显示,包含lncRNA_(PG1)的等位基因对应的MdPG1转录不超过8%。与lncRNA~(-/-)型杂交单株果实相比,lncRNA~(+/+)型果实MdPG1表达量更低,硬度更高;启动子活性分析证实,lncRNA_(PG1)通过顺式作用方式抑制基因表达;全基因组甲基化测序分析表明,lncRNARSL3核磁_(PG1)可能通过改变邻近基因(MdPG1和MD10G1179400)启动子区的甲基化发挥抑制作用。综上所述,本研究挖掘到5个参与调控苹果软化过程的关键候选基因,鉴定到MdPG1启动子区的关键SNP及lncRNA_(PG1),并阐明了关键SNP影响MdCBF2调控MdPG1等位基因表达的分子机制;明晰了lncRNA_(PG1)抑制MdPG1表达的顺式作用方式。研究结果为解析MdPG1表达调控机制提供了新见解,同时为lncRNA在调控苹果软化方面的功能研究奠定了理论基础。