苦荞(Fagopyrum tataricum)作为荞麦属重要的药用作物,因富含有益于人体健康的类黄酮化合物而成为当前研究的热点。花色苷和原花青素是苦荞中重要的类黄酮化合物,参与植物的色素沉着及抵御胁迫,对人畜健康益处颇丰。其生物合成受到转录水平的调控,然而对于bHLH转录因子参与苦荞花色苷和原花青素合成的调控机理知之甚少,因此研究苦荞花色苷和原花青素合成的调控机理对于完善苦荞花色苷和原花青素合成调控网络具有重要的价值,为培育高品质的苦荞品种提供重要的理论依据。本研究基于拟南芥bHLH家族成员中正调控花色苷和原花青素生物合成的At TT8蛋白序列,利用苦荞数据库检索出其同源蛋白。然后以‘晋荞2号’为实验材料,克隆相应基因并进行序列分析、组织特性表达分析、系统进化分析以及亚细胞定位和转录激活实验。同时,构建过表达载体(p MDC83::FtTT8),转化拟南芥突变体attt8和红花烟草K326以验证FtTT8转录因子的功能,通过酵母单杂技术验证FtTT8与靶标基因的互作研究。主要结果如下:(1)从苦荞基因组数据中筛选到拟南芥At TT8的同源蛋白Ft Pin G0008212200.01.T02。从‘晋荞2号’芽菜中成功克隆到完整的CDS序列,命名为FtTT8。测序比对结果显示其与Ft Pin G0008212200.01.T02转录本序列完全一致,其开放阅读框全长为2199 bp,编码732个氨基酸,预估该蛋白的分子量为80.52Empagliflozin分子式9 KDa。(2)FtTT8与其他物种中具有调控花色苷和原花青素合成的bHLH转录因子进行多序列比对,结果表明FtTT8具有典型的bHLH结构特征,即保守的MIR、bHLH及ACT-like结构域。系统发育分析表明FtTT8与枫香Lf TT8的亲缘关系最近,且聚为同一分支的成员含有相似的基序。(3)共表达分析表明FtTT8与大多数花色苷和原花青素合成结构基因具有相似的表达模式,即在不同组织均有表达且叶中积累量最高,结果暗示FtTT8转录因子可能参与调控这些结构基因的转录表达进而影响花色苷或原花青素的合成。拟南芥原生质体转化实验和酵母双杂交实验结果表明FtTT8是一个在细胞核中表达的转录激活因子,行使转录因子的功能。(4)拟南芥遗传转化实验表明FtTT8异源过表达拟南芥attt8突变体后能抑制花色苷的积累促进原花青素的合成。幼苗表型观察表明FtTT8回补拟南芥tt8突变体(35S:FtTT8)、attt8突变体(tt8)与野生型(WT)相比无明显花色苷积累,叶片经DMACA染色后35S:FtTT8系和WT叶片出现较少的蓝色斑点;其花色苷含量测定表明35S:FtTT8系相比WT极显著下调花色苷的积累,与tt8突变体无显著差异;此外原花青素含量测定表明35S:FtTT8系相比tt8突变体显著上调原花青素的积累且WT的原花青素积累量显著高于tt8突变体和35S:FtTT8。q RT-PCR分析表明35S:FtTT8系相比tt8突变体显著上调花色苷和原花青素合成基因的表达,35S:FtTT8系与野生型相比,极显著抑制DFR、ANS及UFGT的表达,而极显著上调CHS、F3H的转录水平,上调CHI及ANR的表达,抑制花色苷合成促进原花青素得积累,这与表型观察和生理检测结果相吻合。种子中表型观察结果表明35S:FtTT8系使淡黄色种子表型恢复至野生型颜色,且经DMACA染色后与tt8黄色种子相比,35S:FtTT8系和WT种子均被染成蓝紫色;其相对应的原花青素含量测定表明35S:FtTT8系原花青素含量约是WT的1.8倍,tt8的5.3倍,由此可见FtTT8显著提高了原花青素的积累;q RT-PCR分析相关基因转录水平结果表明35S:FtTT8系极显著上调tt8突变体中CHI、F3H和ANR的转录表达,上调Bio-inspired computingDFR、ANS的表达,35S:FtTT8株系相比野生型,极显著上调DFR的表达,上调ANR基因表达,促进原花青素的合成,这与表型观察和生理检测结果相一致。(5)烟草遗传转化实验表明FtTT8异源过表达野生型K326红花烟草抑制花色苷的合成且促进原花青素的积累。烟草花表型观察结果表明烟草过表达FtTT8系(OE-FtTT8)中相比野生型花的颜色明显变浅,经DMACA染色后两者无明显差异。其花色苷含量测定结果表明以WT为对照,OE-FtTT8系中的花色苷积累量显著下降;而原花青素含量测定结果表明OE-FtTT8系与WT无显著差异。相关基因转录水平分析结果表明以WT对照相比,OE-FtTT8系极显著上调了F3’H和DFR的转录水平,而其他合成基因均被显著下调。OEFtTT8系烟草叶片与WT相比无明显颜色差异,经DMACA染色后OE-FtTT8系能明显看出深蓝色斑点且富集程度较WT密集,此外花色苷含量测定结果表明OE-FtTT8中的花色苷积累水平显著低于WT,而原花青素的含量显著高于WT,结果表明OE-FtTT8中的原花青素含量约是WT的2.8倍。q RT-PCR结果表明OE-FtTT8与WT对照相比,除UFGT基因极显著下调和ANR基因无显著差异表达外,其他合成相关基因的转录水平极显著上调,如LAR、ANS、DFR等增幅最为明显,由此说明异源过表达FtTT8抑制烟草花色苷的积累,促进原花青素合成。ICI 46474分子量(6)酵母单杂交实验表明FtTT8分别与原花青素合成关键酶基因At ANR及花色苷合成转运基因At UFGT的启动子结合,可能激活它们的表达从而参与调控拟南芥花色苷和原花青素合成,但其具体调控机理还需深入研究。综上所述,初步探索了FtTT8参与调控拟南芥和烟草花色苷和原花青素合成通路,为苦荞花色苷和原花青素合成的分子调控网络提供了理论依据。