目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的神经退行性疾病之一,脑组织的能量代谢障碍在其发生发展过程中具有极其重要的作用。前期研究显示,针灸可通过提高大脑能量代谢来改善AD认知功能障碍,但其关键机制尚不明确。本研究运用空间转录组测序(spatial transcriptomics,ST)等技术,从大脑海马区基因表达及其功能探索等方面,探讨艾灸对AD海马区能量代谢的促进作用,并进一步明确其关键机制。方法将筛选合格的5月龄APP/PS1小鼠随机分为APP/PS1组和APP/PS1+MOX组,同月龄雄性C57BL/6J小鼠作为Ctrl组,每组20只。选取“百会”、“涌泉”穴进行艾灸干预,每日1次,每次30 min,每周5次,连续4周。左右“涌泉”穴隔日交替使用。治疗结束后,(1)运用Morris水迷宫检测小鼠的学习记忆能力;运用免疫荧光技术检测海马区病理标志物β-淀粉样蛋白(beta-Amyloid(1-42),Aβ_(1-42))和磷酸化Tau蛋白(phosphorylated tau,p-Tau)的表达;(2)运用ST测序,通过分析海马区差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)Src抑制剂、功能富集及运用Seurat package的Add Module Score功能计算代谢相关通路基因集的表达分数,以研究艾灸是否影响海马区能量代谢;运用生化实验检测血清中葡萄糖含量,海马组织中的丙酮酸、乳酸和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量;运用透射电镜检测线粒体结构变化;(3)运用ST测序,通过分析代谢相关的共同差异表达基因(common differentially expressed genes,co-DEGs)及运用Cytoscape软件中的cyto Hubba插件中的Mc Creight(MCC)算法筛选其中的核心基因,以探索艾灸影响海马区能量代谢的关键机制;运用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)、免疫荧光和蛋白免疫印迹技术检测相关基因及蛋白的表达;运用免疫荧光和蛋白免疫印迹技术检测海马区突触可塑性相关蛋白突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95)和突触素(Synaptophysin,SYN)的表达。结果1.艾灸改善APP/PS1小鼠认知功能及抑制海马区病理标志物产生的效应观察(1)Morris水迷宫实验结果:与Ctrl组相比,APP/PS1组定位航行实验中的平均逃逸潜伏期和平均游泳路程明显增加(均P<0.001),而空间探索实验中的平台穿越次数、目标象限滞留时间百分比、目标象限游程百分比明显减小(P<0.001,P<0.01,P<0.01);与APP/PS1组相比,APP/PS1+MOX组定位航行实验中的平均逃逸潜伏期和平均游泳路程显著下降(P<0.01,P<0.001,P<0.001),而空间探索实验中的平台穿越次数、目标象限滞留时间百分比和目标象限游程百分比显著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。(2)病理标志物Aβ_(1-42)和p-Tau免疫荧光结果:与Ctrl组相比,APP/PS1组海马的CA1区、CA3区和DG区的Aβ_(1-42)和p-Tau的阳性表达均显著上升(P<0.01,P<0.01,P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001);与APP/PS1组相比,APP/PS1+MOX组海马的CA1区、CA3区和DG区的Aβ_(1-42)和p-Tau的阳性表达均明显减少(P<0.01,P<0.01,P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001)。2.基于空间转录组测序研究艾灸对APP/PS1小鼠海马区能量代谢的影响(1)ST测序分析结果:对海马区DEGs进行分析,与Ctrl组相比,APP/PS1组有1287个DEGs;与APP/PS1组相比,APP/PS1+MOX组有500个DEGs;其中艾灸作用的关键DEGs有368个。通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,APP/PS1组vs.Ctrl组、APP/PS1+MOX组vs.APP/PS1组的DEGs均主要富集到三个方面的通路,包括亨廷顿病、AD、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、帕金森病在内的神经退行性疾病相关通路,氧化磷酸化、柠檬酸循环(TCA循环)、丙酮酸代谢等在内的多条重要代谢相关通路,以及谷氨酸突触、长时程增强以及突触囊泡循环在内的突触相关通路;基因本体论(Gene Ontology,GO)富集结果显示,APP/PS1组vs.Ctrl组、APP/PS1+MOX组vs.APP/PS1组的DEGs富集的条目也基本一致,生物过程(Biological Process,BP)主要包括核糖体生物发生、氧化磷酸化等,细胞定位(Cellular Component,CC)主要包括核糖体、线粒体蛋白复合物和突触后密度等,分子功能(Molecular Function,MF)主要包括核糖体结构组成等。基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)结果显示,APP/PS1组vs.Ctrl组的全基因集富集了29条KEGG通路,APP/PS1+MOX组vs.APP/PS1组则富集了25条KEGG通路,与前面分析结果一致,两个全基因集均富集到包括帕金森病、亨廷顿病、AD和肌萎缩性脊髓侧索硬化症在内的神经退行性疾病相关通路,以及氧化磷酸化、丙酮酸代谢在内的代谢相关通路,且上述通路在APP/PS1组selleck化学vs.Ctrl组和APP/PS1+MOX组vs.APP/PS1组中具有相反的趋势;同时,两个全基因集也富集到了氧化磷酸化、线粒体蛋白复合物等与代谢功能相关的GO条目,均趋势相反。对海马区各个spot代谢相关通路基因集进行打分,结果显示,与Ctrl组相比,APP/PS1组的CA1区、CA3区和DG区的分数明显下降(均P<0.001);与APP/PS1组相比,APP/PS1+MOX组各亚区的分数显著增加(均P<0.001)。(2)代谢功能相关指标检测结果:通过生化实验检测发现,与Ctrl组相比,APP/PS1组血清中的葡萄糖含量明显升高(P<0.01),而海马组织中的丙酮酸、乳酸和ATP含量降低(P<0.01,P<0.05,P<0.01);与APP/PS1组相比,APP/PS1+MOX组血清中的葡萄糖含量降低(P<0.05),而海马组织中的丙酮酸、乳酸和ATP含量增多(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。线粒体透射电镜结果显示,Ctrl组海马区线粒体形态规则,两层膜结构清晰;APP/PS1组线粒体形态异常,线粒体膜模糊增厚,嵴破裂溶解;APP/PS1+MOX组线粒体超微结构与Ctrl组相似,形态较规则,内外膜结构清晰。与Ctrl组相比,APP/PS1组海马区线粒体数量增加,长度明显减小(P<0.05,P<0.01);APP/PS1+MOX组相较于APP/PS1组,线粒体数量减少,长度增加(P<0.05,P<0.01)。3.基于空间转录组测序探索艾灸促进APP/PS1小鼠海马区能量代谢的关键靶点(1)代谢相关co-DEGs分析结果:将368个艾灸作用的关键DEGs与代谢相关通路基因集取交集,获得31个代谢相关co-DEGs,其在Ctrl组与APP/PS1+MOX组的表达水平相似。筛选代谢相关co-DEGs中MCC分数排名前10位的核心基因,包括Ndufs6、Ndufb4、Ndufa12、Ndufs5、Ndufc2、Ndufb11、Ndufb6、Atp5h、Atp5o及Sdhd,以线粒体呼吸链复合体Ⅰ亚基的编码基因为主。(2)呼吸链复合体Ⅰ亚基的qRT-PCR、免疫荧光及免疫蛋白印迹检测结果:与Ctrl组相比,APP/PS1组海马区的Ndufs6、Ndufb4、Ndufa12、Ndufs5、Ndufc2、Ndufb11及Ndufb6的m RNA表达水平均显著降低(P<0.001,P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.05);与APP/PS1组相比,APP/PS1+Prosthesis associated infectionMOX组复合体Ⅰ各亚基的m RNA表达水平均明显增加(P<0.001,P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.001,P<0.05,P<0.05)。并且与Ctrl组相比,APP/PS1组海马区的Ndufs6蛋白表达量显著减少(P<0.001),且其在海马各亚区阳性表达均下降;与APP/PS1组相比,APP/PS1+MOX组的Ndufs6蛋白表达量明显增加(P<0.01),且其在海马各亚区阳性表达均上升。(3)突触可塑性相关分析结果:将368个艾灸作用的关键DEGs与突触相关基因集取交集,获得10个突触相关co-DEGs,对其在海马区各个spot的表达量进行打分,与Ctrl组相比,APP/PS1组的表达分数明显减少(P<0.001);APP/PS1+MOX组相较于APP/PS1组,表达分数明显增加(P<0.001)。对三组海马区各个spot的代谢相关co-DEGs和突触相关co-DEGs的表达水平进行相关性分析,发现二者表达水平呈正相关(r=0.707,P<0.001)。进一步通过免疫荧光和蛋白免疫印迹对突触可塑性相关蛋白PSD95、SYN进行检测,与Ctrl组相比,APP/PS1组海马区的PSD95、SYN蛋白表达量显著减小(P<0.001,P<0.05),且CA1区和DG区的PSD95/SYN阳性共表达下降;APP/PS1+MOX组相较于APP/PS1组,海马区的PSD95、SYN蛋白表达量明显增加(P<0.001,P<0.05),且CA1区和DG区的PSD95/SYN阳性共表达上升。结论1.艾灸可改善APP/PS1小鼠学习记忆能力,抑制海马区病理标志物Aβ_(1-42)和p-Tau蛋白的产生。2.艾灸能促进海马区氧化磷酸化、丙酮酸代谢等多条代谢相关通路基因及线粒体内膜蛋白复合物基因的表达,并能提高海马区能量代谢产物的含量及改善线粒体结构。3.线粒体呼吸链复合体Ⅰ亚基可能是艾灸促进APP/PS1小鼠海马区能量代谢的关键靶点,且通过其提高的能量代谢可能与突触可塑性的改善相关。