背景:自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)是一种复杂的、具有高度遗传异质性的神经发育障碍疾病。遗传因素与环境因素的刺激等多种因素均是引起ASD发病的危险因素。四次跨膜蛋白7(Tetraspanin7,TSPAN7)是一种由位于X染色体上的Tspan7基因所编码的细胞表面糖蛋白,在脑组织中高度表达。在生理状态下,TSPAN7参与突触传递、神经元形态发生、树突状细胞(dendritic cell,DCs)和破骨细胞形态发生。研究发现,Tspan7的拷贝数变异与人类ASD的发生和发展密切相关。然而,TSPAN7在ASD的突触和突触完整性层面的潜在机制仍不清楚。为探究TSPAN7在自闭症中的作用,我们利用CRISPR/Cas9技术构建一个Tspan7基因敲除大鼠品系,以期建立Tspan7基因敲除的ASD大鼠模型,并利用该模型探究TSPAN7在自闭症中的作用机制。方法:(1)利用生物信息学分析、PCR、蛋白质印迹(Western blot,WB)和免疫荧光检测TSPAN7序列特征和表达谱。(2)通过CRISPR/Cas9技术构建Tspan7基因敲除大鼠品系(Tspan7-/-),并利用PCR和WB对其进行基因型鉴定和蛋白表达鉴定。(3)通过旷场、糖水偏好、三箱社交、Y迷宫和Morris水迷宫实验对野生型(Wild Type,WT)大鼠和Tspan7-/-大鼠在刻板行为、快感缺失、社交活动、学习记忆等四方面自闭症的行为表型进行分析。(4)应用核磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)、苏木素伊红染色(haematoxylin-eosin staining,HEPARP抑制剂)和 Nissl 染色分析Tspan7-/-大鼠整体脑结构和神经元数量的改变。(5)通过qRT-PCR和Golgi-Cox染色观察Tspan7-/-大鼠大脑ASD相关基因的表达和神经元分支和树突棘数量的改变。采用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测Tspan7-/-大鼠大脑神经元突触完整性。(6)采用WB和IF分析TSPAN7缺失引起的下游信号通路的表达变化。结果:(1)在生理条件下,TSPAN7在哺乳动物中的蛋白序列是高度保守的,在大鼠脑组织中表达最高。同时,TSPAN7蛋白在出生时表达较低,从0.5月龄开始至4月龄TSPAN7的表达明显增加。TSPAN7的亚细胞定位主要是在神经元细胞膜上高度表达。在病理条件下,TSPAN7在ASD、亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者的脑组织中呈现低表达趋势,表明TSPAN7在神经系统疾病的发展进程中起关键作用。(2)成功构建Tspan7基因敲除大鼠,旷场、糖水偏好、三箱社交、Y迷宫和Morris水迷宫实验结果显示Tspan7-/-大鼠表现出刻板行为增多、快感降低、社交减少以及学习记忆损伤等ASD的典型行为学表型。(3)影像学结果显示:Tspan7-/-大鼠在整体水平表现出海马和大脑皮层体积减小的大脑结构的改变。(4)组织形态学显示,Tspan7-/-大鼠大脑海马区神经元数目减少并且排列松散。Tspan7-/-大鼠海马和大脑皮层的神经元树突和轴突分支、神经元复杂度、神经元顶端树突和基底树突的树突棘明显减少。(5)TSPAN7缺失导致大鼠大脑海马和皮层PSD95和SYN等突触相关蛋白表达和PSD95免疫标记的突触后膜和SYN免疫标记的突触前膜重叠点明显减少。(6)TSPAN7缺失抑制Integrinβ1/FAK/SRC信号通路的激活,进而下调PSD95、SYN和GluR1/2等突触相关蛋白的表达。(7)在Tspan7-/-大鼠原代神经元中,原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC(Proto-Oncogene Tyrosine-Protein Kinase Src,SRC)的重新激活能够恢复 PSD95、SYN 和GluR1/2等突触相关蛋白的表达和突触完整性。结论:TSPAN7在哺乳动物中的蛋白序列是高度保守的,并且在神经系统疾病的发展中起关键作用。我们成功构建Tspan7-/-大鼠,该大鼠出现刻板行为增多、快感降低及社交减少等行为学改变,再现人类ASBcl-2抑制剂D行为学表型;Tspan7-/-大鼠海马和皮层的神经元树突和轴突分支、神经元复杂度、神经元顶端树突和基底树突的树突棘明显减少,与人类ASD的脑组织病理学改变具有相似性;Tspan7-/-大鼠可作为人类ASD的动物模型。利用模型发现TSPAN7缺失通过抑制Integrinβ1/FAK/SRC信号通路激活,引起突触相关蛋白降低和突触完整性损失,是导致ASD的重要发病机制。背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以认知功能障碍为主要特征的神经退行性疾病。遗传因素和环境因素等多方面危险因素,造成治疗和药物研发的困难,目前有限的几种药物存在多种不良反应。因此,AD药物研发是迫切需要的。随着对中药成分的深入了解,研究发现吴茱萸碱(evodiamine,Evo)可以改善AD模型小鼠的学习认知功能障碍。然而,Evo具有较高的细胞毒性和较差的生物活性,将Evo直接用于临床AD的治疗是不可行的。因此,本课human cancer biopsies题通过杂环取代和酰胺引入,设计和合成一系列的Evo衍生物,并从中筛选出具有较低细胞毒性和较高生物活性的化合物4c,并探究其治疗AD的作用机制。方法:(1)使用1,2-二甲氧基苯替代吴茱萸碱的吲哚环,通过杂环取代,合成吴茱萸碱衍生物,并通过核磁共振、高分辨质谱对其结构进行鉴定分析。(2)使用吴茱萸碱衍生物干预SH-SY5Y和HepaG2细胞系,利用CCK-8、Calcein-AM/PI染色和xCELLigence实时细胞分析等方法检测其细胞毒性、抗H2O2和AβOs活性。(3)将筛选出的化合物4c进行体内实验,将化合物4c腹腔注射至3×Tg和APP/PS1两种AD模型小鼠体内,并利用Y迷宫和Morris水迷宫检测化合物4c对两种AD模型小鼠学习记忆损伤的治疗作用。(4)通过免疫荧光、免疫组化、免疫印迹等方法评价化合物4c对3×Tg和APP/PS1两种AD模型小鼠脑内Tau过度磷酸化、淀粉样物质的聚集和神经胶质细胞增生水平的影响。(5)利用转录组测序分析化合物4c对3×Tg模型小鼠后海马组织的mRNA表达的影响,并对其差异基因进行KEGG和PPI网络分析。(6)通过qRT-PCR、免疫印迹和免疫荧光对差异基因进行验证,并分析化合物4c治疗AD潜在的作用机制。结果:(1)以吴茱萸碱为原型,通过杂环取代,共合成21种吴茱萸碱衍生物。其中,化合物4c具有较低的细胞毒性和较高的抗H2O2活性。(2)与吴茱萸碱相比,化合物4c表现出更高的LD50、抗H2O2和AβOs能力。(3)在Y迷宫实验中,与模型对照组相比,化合物4c干预组3×Tg和APP/PS1模型小鼠的自发交替正确率明显增加;Morris水迷宫实验结果显示,与模型对照组相比,化合物4c干预组3×Tg模型小鼠潜伏期探索隐藏平台的时间明显缩短,小鼠平台穿越次数、目标象限持续时间明显增加。提示,化合物4c明显改善AD模型小鼠的工作记忆和空间学习记忆。(4)化合物4c干预组3×Tg模型小鼠脑组织内Ser202/Thr205(AT8),Thr231(T231)和Thr181(T181)等磷酸化位点的Tau磷酸化水平下降。(5)化合物4c干预组APP/PS1小鼠海马和皮层的Aβ单体、寡聚体和淀粉样物质的聚集明显较少。(6)化合物4c干预组APP/PS1小鼠海马和皮质中Aβ斑块周围的小胶质细胞和星形细胞的聚集明显减少。(7)化合物4c干预组3×Tg模型小鼠脑组织内胰岛素信号、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)等AD相关信号通路相关mRN A表达明显下降。(8)化合物4c干预组3×Tg模型小鼠脑组织内PI3K和AKT的磷酸化水平显著增加,下游GSK3β蛋白的磷酸化水平显著下降,研究结果提示,化合物4c可改善AD模型小鼠脑组织内PI3K/AKT/GSK3β信号通路的损伤。(9)细胞实验结果显示,化合物4c改善Aβ引起的SH-SY5Y细胞内PI3K/AKT/GSK3β/Tau 功能紊乱。结论:本课题通过杂环取代和酰胺引入,设计并合成一系列吴茱萸碱衍生物,从中筛选出化合物4c,经研究发现化合物4c在体外具有较低的细胞毒性和较高的抗H2O2和AβOs活性,在体内研究证实化合物4c明显改善AD模型小鼠行为学损伤、减少AD模型小鼠脑组织内β淀粉样物质的聚集、Tau的过度磷酸化以及胶质细胞的增生。同时,与吴茱萸碱相比,化合物4c的LD50提高2倍,体内治疗的有效剂量降低约500倍,化合物4c是一种改进成功的治疗AD的先导化合物。此外,为探究化合物4c的作用机制,通过RNA-seq和通路富集分析发现,化合物4c能够影响AD相关基因、AMPK和胰岛素信号通路相关基因的表达。通过体内和体外实验证实化合物4c可以改善PI3K/AKT/GSK3β/Tau的功能障碍。