背景:牙髓组织受到龋齿、外伤或特发性因素的损害,容易引起牙髓炎症甚至不可逆的牙髓坏死。临床治疗牙髓炎或牙髓坏死最常用的方法是根管治疗,以去除感染的牙髓组织、细菌等。牙齿失去牙髓后,由于resistance to antibiotics缺乏固有的天然生物防御能力和营养功能,变得十分脆弱,容易发生折裂,甚至造成牙缺失,影响牙列完整性和美观,降低咬合咀嚼功能和生活质量。基于组织工程策略的再生牙髓治疗通过替换感染和坏死的牙髓组织;恢复牙齿的活力;促进牙根的生长发育引发了广泛关注。然而,基于根管系统的复杂性(根管数目多、管道狭窄、存在管间交通)和牙髓组织结构的复杂性(富含神经、血管、胶原纤维)等,导致目前用于牙髓组织工程的支架材料仍存在很大限制。例如,预成型的支架材料,由于其形状固定而导致无法完全填充弯曲且狭窄的根管系统。可注射水凝胶材料虽然在形状上具有广泛适应性,但其注射入根管内部后中心区域常发生缺血性坏死。由水凝胶材料衍生的凝胶微球不但体积更小,可以顺利通过常规注射针头,适用于复杂的根管系统;同时具有良好生物相容性,可作为细胞培养以及批量扩增的支架材料。但单纯的支架材料不具备组织特异性,缺乏调控组织再生的关键信号。细胞外基质中富含的功能性生物因子有助于构建用于组织重塑的诱导微环境,并可调控细胞命运。因此利用细胞外基质来源的生物活性因子对凝胶微球进行牙髓组织特异性的功能化改性,从而构建引导牙髓组织再生的特异性支架材料,最终实现牙髓组织再生。目的:(1)利用脱细胞牙髓基质来源的生物活性因子对凝胶微球表面进行功能化改性,构建引导牙髓组织再生的特异性支架材料;(2)通过体外实验研究脱细胞牙髓基质功能化凝胶微球诱导牙髓干细胞向成牙本质,成血管以及成神经等多向分化的能力;(3)通过体内半原位动物模型研究脱细胞牙髓基质功能化凝胶微球能否促进牙髓组织再生。方法:(1)本实验第一部分首先利用化学循环法对牙髓组织进行去细胞化处理以去除其免疫原性;再通过胃蛋白酶消化作用将脱细胞牙髓基质溶液化以获得可溶性复合生物活性因子。其次利用微流控技术,调节油相NSC 119875临床试验速度以制备大小适合复杂根管系统的凝胶微球。最后通过EDC/NHS(N-(3-dimethylamino propyl)-N’-ethyl carbon diimi ne hydrochlori-de,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)/(N-hydroxy succinimide,N-羟基琥珀酰亚胺)促进的酰胺反应实现凝胶微球表面脱细胞牙髓基质生物活性因子功能化改性。(2)本实验第二部分首先通过活死细胞染色、细胞增殖CCK-8(Cell Counting Kit-8,细胞计数试剂)实验、细胞增殖相关抗原免疫荧光染色、细胞骨架染色等实验检测了功能化凝胶微球对牙髓干细胞的活性以及增殖能力的影响。其次,通过免疫荧光染色、q PCR(Real-time Quantitative polymerase c hain reaction,实时荧光定量聚合酶链式反应)、蛋白质免疫印迹实验等检测功能化凝胶微球对牙髓干细胞成牙本质、成血管以及成神经等多向分化的诱导能力。(3)本实验第三部分首先利用离体前磨牙构建了用于半原位牙髓再生的牙齿支架,并通过扫描电镜观察其内部牙本质小管。其次利用裸鼠皮下半原位模型检测功能化凝胶微球再生牙髓组织的能力。最后通过H&E(Hematoxylin-eosin staining,苏木精-伊红染色)和Masson染色分析新生的牙髓组织,免疫组化染色检测新生的血管以及成牙本质细胞。结果:本研究主要得到了以下结果:1、成功利用微流控技术制备了直径为178μm的可注射凝胶微球以适应复杂根管系统;2、利用化学循环脱细胞法及胃蛋白酶消化法将实质的牙髓组织制备成富含多种牙源性生长因子的脱细胞牙髓基质溶液;3、多种体外实验证实:酰胺反应将脱细胞牙髓基质来源的生物活性因子枝接于凝胶微球表面,成功构建了牙髓特异性三维微环境支架材料-功能化凝GPCR & G Protein抑制剂胶微球。4、体外实验表明脱细胞牙髓基质功能化凝胶微球dp ECM@GM具有良好的生物相容性,细胞能在其表面粘附,持续增殖;可诱导h DPSCs成牙本质、成血管以及成神经向分化。5、体内裸鼠皮下半原位牙髓再生模型实验证明:荷载h DPSCs的dp ECM@GM微载体的能初步实现牙髓-牙本质复合物的再生,包括形成富含血管的类牙髓样组织、新生牙本质形成且牙本质小管结构清晰、富集的成牙本质细胞等。在体内具有良好的生物安全性,未对全身重要脏器产生毒性。结论:脱细胞牙髓基质功能化的凝胶微球具有良好的生物相容性;体外能诱导牙髓干细胞向成牙本质、成血管以及成神经分化等多向分化;并且具有牙髓组织特异性生物线索以指导牙髓干细胞在半原位模型中实现牙髓-牙本质复合物的再生。综上所述,本研究首次构建了一种脱细胞牙髓基质功能化的凝胶微球,并且具有应用于牙髓再生的临床潜力。