卵泡发育是雌性动物生殖生理的一个基本过程。生殖干细胞在生殖嵴中分化为卵原细胞,卵原细胞通过有丝分裂分化为卵母细胞,在卵原细胞分化的过程中,由体细胞(前颗粒细胞)包裹形成原始卵泡。因此,原始卵泡的组装对于雌性获得生育能力至关重要。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养素家族的一员,在哺乳动物卵泡发育的生理过程中起至关重要的作用。原肌球蛋白激酶受体B(Trk B)作为BDNF的高亲和力受体,与BDNF结合后可激活多条细胞内信号通路,维持细胞存活和促进细胞生长。micro RNA(miRNA)作为一种重要的表观遗传调控方式,通过结合靶基因的3’UTR区抑制靶基因的表达,参与各种生物过程的调控,在卵泡发育、卵母细胞成熟和早期胚胎生长中发挥着关键作用。虽然BDNF对猪卵泡发育和卵母细胞成熟的影响已被证实,然而BDNF对猪卵泡颗粒细胞增殖的调控机制尚未阐明。因此,本研究探讨了BDNF调控的miRNA在猪卵泡颗粒细胞增殖中的作用机制。研究内容和结果如下:1 BDNF对猪卵泡颗粒细胞增殖的影响为了确定BDNF对猪卵泡颗粒细胞增殖的影响。首先通过免疫荧光技术鉴定了BDNF和受体Trk B在猪卵泡颗粒细胞中的表达,然后采用ELISA检测了BDNF的合成与分泌,结果显示猪卵泡颗粒细胞能够合成并分泌BDNF。通过外源性添加BNDF或合成si RNA干扰内源性BDNF表达发现,BDNF能够促进猪卵泡颗粒细胞活力、S期细胞比率和增殖相关基因(CCND1、P21和BCL2)的表达,抑制凋亡基Mirdametinib使用方法因BAX的表达;BDNF表达沉默抑制猪卵泡颗粒细胞的增殖。2 BDNF通过Trk B调控猪卵泡颗粒细胞增殖为了确定BDNF促进猪卵泡颗粒细胞增殖是否通过Trk B,本研究通过使用Trk B受体抑制剂K252α阻断BDNF/Trk B信号转导,检测猪卵泡颗粒细胞增殖情况。结果表明,添加K252α显著抑制了猪卵泡颗粒细胞的活力、S期细胞比率和增殖相关基因(CCND1、P21和BCL2)的表达(p<0.05),上调了凋亡基因BAX的表达,说明Trk B有利于猪卵泡颗粒细胞的增殖。添加K252α后再经BNDF处理,BDNF诱导的猪卵泡颗粒细胞增殖水平显著下降,说明BDNF通过Trk B促进猪卵泡颗粒细胞增殖。3 BDNF通过MAPK/ERK1/2信号通路促进猪卵泡颗粒细胞增殖为了确定MAPK/ERK信号通路是否参与BDNF诱导的猪卵泡颗粒细胞增殖,检测了不同时间段BDNF(100 ng/m L)处理后细胞中ERK1/2的磷酸化水平。BDNF处理15 min(p<0.05)和30min(p<0.01)时p-ERK1/2的水平均升高,表明BDNF激活了MAPK/ERK1/2信号通路。K252α和BDNF联合作用试验结果表明,抑制BDNF/Trk B信号转导,使BDNF诱导的猪卵泡颗粒细胞中ERK1/2的磷酸化受阻。说明BDNF通过Trk B激活MAPK/ERK1/2信号通路。此外,还评估了MAPK/ERK1/2信号通路对猪卵泡颗粒细胞增殖的影响,细胞用BDNF和PD98059(MAPK抑制剂,15μM)处理。结果显示,BDNF对细胞活力和S期细胞比率的影响减弱,并且通过阻断ERK1/2磷酸化抑制了CCND1的表达水平。说明BDNF通过MAPK/ERK1/2信号通路调控CCND1促进猪卵泡颗粒细胞增殖。4 micro RNA参与BDNF对猪卵泡颗粒细胞的增殖为了确定miRNA是否参与BDNF诱导的猪卵泡颗粒细胞增殖,将si-Dicer1转染到细胞中,然后再经BDNF处理。结果显示,抑制Dicer1后,BDNF诱导的细胞活力、S期细胞比率及BCL2、P21、CCND1 m RNA和蛋白表达水平下调(p<0.05),BAX表达水平上调(p<0.05)。这些结果表明,Dicer1敲低抑制了猪卵泡颗粒细胞的增殖,miRNA参与了BPCR ThermocyclersDNF诱导的细胞增殖过程。5 BDNF调控猪卵泡颗粒细胞增殖的miRNA表达谱的解析为了明确猪卵泡颗粒细胞中,BDNF调控的miRNA的表达谱,细胞经BDNF处理后,采用miRNA高通量测序技术,筛选差异表达的miRNA。结果表明,筛选出受BDNF调控的差异miRNA 72个,其中上调34个,下调38个;其靶基因功能主要富集于细胞生长、细胞代谢以及刺激反应等多个生物进程,并与MAPK信号通路、NF-κB信号通路、神经营养因子信号通路、胰岛素信号通路以及卵巢类固醇生成通路等30个信号通路相关。选择与细胞生长进程及MAPK信号通路关联的6个miRNA同细胞增殖的表型(细胞活力和细胞周期)进行相关性分析,发现miR-185、miR-532和miR-127与细胞活力相关,miR-127与细胞周期相关。说明miR-127可能是BDNF诱导猪卵泡颗粒细胞增殖过程中的关键miRNA。6 miR-127介导了BDNF经MAPK/ERK1/2信号通路对CCND1的调控为了阐明miR-127在BDNF诱导猪卵泡颗粒细胞增殖中的作用机制,进一步研究了miR-127与Trk B、MAPK/ERK1/2信号通路以及CCND1之间的表达关系。结果表明,BDNF通过Trk B下调miR-127的表达;抑制miR-127表达能够刺激ERK1/2的磷酸化,激活MAPK/ERK1/2信号通路;此外,miR-127负调控CCND1的表达。这些结果表明,在BDNF经MAPK/ERK1/2信号通路调控CCND1表达的过程中,miR-127发挥了介导作用。综上所述,BDNF及受体Trk B在猪卵泡颗粒细胞中表达,并且猪卵泡颗粒细胞能够分泌BDNF。BDNF通过下调miR-127和激活MAPK/ERK1/2信号通路,促进了细胞中CCND1的表达,使细胞由G1期向S期转变,从E-616452而促进猪卵泡颗粒细胞增殖。这些一发现为进一步研究猪卵泡发育过程中颗粒细胞的生物学功能提供新思路和实验依据。