【目的】观察人脐带间充质干细胞来源外泌体(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Exosomes,hUCMSCs-ex)联合切痂植皮术对大鼠烫伤创面修复的效果及初步探索其剂量及作用机制,为今后hUCMSCs-ex的临床应用提供理论基础以及新的思路。【方法】通过建立大鼠皮肤烫伤后切痂植皮模型,以hUCMSCs-ex作为干预治疗措施,采用非标记定量蛋白质组学(Label-free)技术寻找hUCMSCs-ex对大鼠烫伤创面切痂植皮修复作用的差异蛋白变化,并对其参与创面修复过程的分子信号通路进行初步探讨。1.取新生儿脐带组织,采用组织块贴壁法分离提取hUCMSCs。通过观察细胞的形态结构;油红O染色法和茜素红染色法鉴定干细胞成脂分化和成骨分化。收集P3-P6代hUCMSCs的条件培养基,超速离心法提取hUCMSCs-ex。并通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察外泌体形态、大小、结构;纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)检测外泌体的粒径和浓度;蛋白免疫印迹实验检测外泌体表面标志物CD63、CD81、TSG101的表达。2.建立大鼠烫伤模型通过比较创面愈合率观察SB431542金属圈防止创面收缩愈合的作用。再次建立大鼠烫伤模型,分为5组:空白对照组、模型手术+高剂量外泌体(H-EXO组)、模型手术+低剂量外泌体(L-EXO组)、模型手术+磷酸盐缓冲液(PBS组)、模型手术+去外泌体上清液组(EXD组)。术后14d、21d、28d比较各组创面愈合率;HE染色和Masson染色观察创面愈合后各组间创面皮肤组织的病理学改变。3.取H-EXO组、PBS组、空白对照组创面皮肤组织,依靠非标记定量蛋白质组学(Label-free)技术,获得质谱原始数据并确认合格,再进行样本定量结果的重复性进行检验、显著性差异分析及生物信息分析,寻找hUCMSCs-ex对大鼠烫伤创面切痂植皮修复作用的差异蛋白。采用Western Blot检测H-EXO组、PBS组、空白对照组中半胱氨酸蛋白酶抑制剂A(Cystatin A/Stefin A,CSTA/STFA)和Igγ-1链C区蛋白(Ig gamma 1 chain C region,IGHG1)的表达。【结果】1.组织块贴壁法获得原代hUCMSCs,倒置相差显微镜下观察:原代hUCMSCs在组织块底部贴壁生长融合,细胞形态多样,不规则;传代至P1代时,细胞呈多角形;传至P2代后,细胞的形态逐渐拉长,呈长梭形;P3代细胞形态趋于稳定的长梭形,融合至90%的细胞排列紧密,整体呈现漩涡状,生长状态良好。通过茜素红染色成骨诱导的hUCMSCs,其钙盐颗粒呈致密红色结节;油红0染色成脂诱导的hUCMSCs,其脂肪颗粒呈橙红色。透射电子显微镜下观察:提取得到的外Z-IETD-FMK细胞培养泌体分散度较好且大小均一,呈茶托状的双层囊膜结构,中央为低电子密度成分,膜的边界较为清晰,直径在100nm左右,符合间充质干细胞来源外泌体的形态学特征。NTA分析结果显示:原溶液中粒子颗粒浓度(Original Concentration)为5.0×10~8Particles/ml,峰值(Peak Analysis)在127.4nm,符合hUCMSCs-ex的直径大小范围。蛋白免疫印迹实验(Western Blot)结果表明:高表达hUCMSCs-ex表面特异性标志物CD63、CD81、TSG101。2.在金属圈防止创缘收缩的实验中,第一组(切痂+金属圈固定创缘+自体皮片移植+异体皮覆盖)较第二组(切痂+金属圈固定创缘+异体皮覆盖)创面愈率更高;无金属圈固定的第三、四组创面愈合率明显高于金属圈固定创缘的第一、二组。在hUCMSCs-ex对烫伤创面切痂植皮的修复作用的实验中,EXO组移植皮片的存活及融合情况、创面愈合速度及质量较EXAll-in-one bioassayD组和PBS组更优,且H-EXO组优于L-EXO组。EXD组相比PBS组也表现出促进创面愈合的趋势。HE染色及Masson染色观察:H-EXO组及L-EXO组均可见再生的表皮且伴有皮肤附件如毛囊,皮脂腺,层次较分明。H-EXO组胶原生成更多,胶原纤维排列更为整齐,新生血管更多。EXD组见少量皮肤附件生成,但血管生成较L-EXO组更多,未形成角化的上皮,有炎性细胞浸润。PBS组大量炎性细胞浸润,皮肤层次不清,未见皮肤附件生成。3.对PBS组和EXO组进行组间差异分析,log FC取1.2倍且P-value<0.05,共筛选出差异基因332个,其中上调基因162个,下调基因170个。筛选上调基因分析,挑选出IGHG和CSTA两个差异蛋白,其中IGHG的差异表达最为显著。WB结果显示:EXO组相较于PBS组中IGHG1和CSTA的蛋白合成明显升高,差异具有明显的统计学意义(p<0.05);EXO组相较于NORMAL组中IGHG1和CSTA的蛋白合成明显升高,差异具有明显的统计学意义(p<0.05);PBS组相较于NORMAL组中IGHG1和CSTA的蛋白含量差异不明显,无统计学意义。【结论】1.通过组织块贴壁法可获得hUCMSCs;超速离心法能从其条件培养基中分离出hUCMSCs-Ex。2.hUCMSCs-Ex可加速大鼠烫伤创面切痂植皮的修复过程,并改善创面愈合质量。3.hUCMSCs-Ex可能通过高表达IGHG1、CSTA参与创面愈合过程。