羊传染性脓疱皮炎(Contagious ecthyma,CE),又名“羊口疮”,是由羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)引起的以感染绵羊、山羊等中小反刍动物为主的一种急性、高度接触性的传染病。尽管ORFV感染能够诱导机体强烈的免疫应答反应,但ORFV与宿主在长期进化过程形成干扰或破坏宿主免疫反应的能力,进而实现免疫逃逸,导致动物重复感染的发生,羊群一旦被感染则很难清除,成为严重危害养羊业发展的重要动物疫病之一。此外,ORFV也是一种动物源性人兽共患病原,人可通过与患病动物接触发生感染,尤其是从事饲养、屠宰、兽医等行业的工作人员,给全球公共卫生安全带来巨大挑战。疫苗接种目前仍是防控该病的重要手段,但尚缺乏有效的疫苗用于该病的防控,使得疫苗免疫效果不佳甚至免疫失败的现象时有发生。减毒活疫苗具有接种剂量小、免疫力更强、疫苗效果维持时间较长等优点,因此ORFV基因缺失减毒疫苗是未来ORFV新型、高效疫苗研发的一个重点方向。本研究首先利用CPE观察、电镜负染观察、PCR检测、病毒空斑形成试验和TCID_(50)测定、动物生长性能测定、病理学和病原学检测等方法对实验室前期构建的羊传染性脓疱病毒ORF120基因缺失毒株(ORFV-SY17(35)120)的毒力、复制能力、遗传稳定性等生物学特性及安全性进行检测,评估其作为减毒活疫苗候选毒株的潜力。电镜负染和光镜下的观察结果显示,ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株与亲本毒株ORFV-SY17的病毒粒子形态相似,两病毒株感染细胞也呈现出半圆、皱缩等相似的CPE;空斑试验和TCID_(50)测定结果显示,ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株的蚀斑形成能力和增殖能力略低于ORFV-SY17亲本毒株;ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株和ORFV-SY17亲本毒株的一步生长曲线(MOI=10)和多步生长曲线(MOI=0.1)相似,该结果表明ORF120基因缺失对病毒的复制能力无显著影响;将ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株分别连续传达12代,利用PCR技术检测各代次细胞中ORF120基因以及ORF011基因,鉴定ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株的遗传稳定性,结果显示,ORF011基因在ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株中能够稳定遗传;此外,利用TCID_(50)测定ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株各代次毒力,结果显示,ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株的毒力也较为www.selleck.cn/products/pexidartinib-plx3397稳定。Decitabine配制最后,将ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株和亲本毒株ORFV-SY17分别接种羔羊,通过对各组羔羊生长性能、临床症状、病理变化等检测,与ORFV-SY17亲本毒株感染组相比,Biomass reaction kineticsORFV-SY17(35)120基因缺失毒株的致病力较弱,该结果表明,ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株具有良好的安全性。上述研究结果表明,ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株有望作为减毒疫苗候选毒株。活疫苗通常采用与自然感染相类似的途径接种,以往ORFV常规弱毒苗通常采用皮肤划痕的接种方式,尽管该接种途径能诱导机体较强的免疫反应,免疫保护效果较为确实,但存在操作难度大、动物应激反应强及散毒等生物安全问题。基于划痕接种方式的缺陷,本研究对ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株的免疫保护效果进行评估过程中,重点对该毒株的接种方式进行优化,分别将ORFV-SY17(35)120基因缺失减毒株采用皮肤划痕和皮下注射两种途径免疫3-4月龄羔羊,在2 w后进行加强免疫,4 w后用ORFV强毒株进行攻毒。利用ELISA、血清中和实验、Western blot、FACS等对免疫动物不同时间点血液样本中的Ig M、Ig G特异性抗体、ORFV059病毒蛋白抗体,以及细胞因子和T淋巴细胞亚群水平进行检测。结果显示,经划痕免疫和皮下免疫接种ORFV-SY17(35)120基因缺失减毒株均能诱导羔羊ORFV特异性抗体、ORFV059蛋白抗体、Th1/Th2细胞因子、以及CD4~+和CD8~+T淋巴细胞的产生。使用ORFV-SY17毒株进行攻毒,结果表明,无论划痕还是皮下免疫接种ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株,均能提供良好的免疫保护。上述研究结果表明,ORFV120基因的缺失不影响ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株在OFTu细胞上的复制增殖且遗传稳定,ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株对接种羔羊较为安全,确定安全免疫接种剂量为1.5×10~(6.5) TCID_(50)/只。ORFV-SY17(35)120基因缺失毒株有望作为ORFV新型疫苗候选毒株,且皮下注射免疫方式可替代传统的划痕免疫接种途径,为临床针对羊传染性脓疱皮炎的防治提供一种重要的技术手段。