目的:本课题探讨维生素D与Treg细胞在哮喘发病中的作用及其相关性;并在细胞水平阐明维生素D通过β-catenin通路调控Treg细胞免疫炎症反应的潜在分子机制。方法:1、收集2021年1月至2022年4月于山西医科大学第二医院就诊的哮喘急性发作期病患58例为实验组,均达到纳入标准,同期在本院采集健康体检者33例为对照组。收集每位研究对象的空腹血标本离心收集血清,并且收集外周血单个核细胞。应用酶联免疫吸附实验测定血清25(OH)D_3含量;流式细胞术检测Treg细胞比例;RT-q PCR检测Treg细胞表面特异性标志物Foxp3 m RNA表达水平;流式多因子检测技术测定血清炎症因子IL-10、IL-17表达水平。2、体外实验:小鼠胸腺Treg细胞体外培养,分别设置空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+1,25(OH)_2D_3组以及TGF-β1+ICG-001组。除了空白对照组,每孔给予TGF-β1剂量为2 ng/ml,1,25(OH)_2D_3干预剂量为1μmol/l,ICG-001干预剂量为5μmol/l,剂量选择根据课题组前期研究结果采纳应用。采用Western Blot分析Treg细胞特异性标记物、正调控蛋白Foxp3的表达水平;采用RT-q PCR分析Foxp3m RNA、IL-10 m RNA、IL-35 m RNA水平;采用Co IP实验分析各组β-catenin/TCF和β-catenin/Foxo1转录复合物水平;通过双荧光素酶报告基因实验测定Foxo1转录因子对下游Foxp3启动子的转录活性。结果:1、本研究纳入的所有研究对象各组间的性别、GW4869小鼠年龄均无显著差异(P>0.05)。ELISA检测结果表明哮喘急性发作期患者血清25(OH)D_3水平显著低于健康体检者(P<0.05)。流式细胞仪检测结果表明哮喘急性发作期患者Treg细胞比例低于健康体检者(P<0.001)。RT-q PCR结果表明哮喘患者Treg细胞特异性标志物Foxp3的表达水平降低(P<0.05)。流式多因子检测技术结果表明哮喘急性发作期患者血清抗炎因子IL-10表达水平显著降低,促炎因子IL-17表达水平显著升高,哮喘急性发作期患者相比健康体检者IL-17/IL-10比值显著异常(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示抗炎因子IL-10的表达水平与Treg细胞数量比例之间存在显著正相关关系(r=0.5388,P<0.01);促炎因子IL-17的表达水平与Treg细胞比例之间无明显相关性(r=-0.1264,P>0.05)。哮喘急性发作期患者血清25(OH)D_3水平与IL-17/IL-10比值之间存在负相关关系(r=-0.3987,P<0.01),与Treg细胞两者呈正相关关系(r=0.4110,P<0.01)。2、细胞生物学实验结果:Western Blot结果显示TGF-β1组、1,25(OH)_2D_3和ICG-001干预处理组与对照组的检测结果比较,Foxp3蛋白表达均上调(P<0.05)。与TGF-β1诱导组相比,1,25(OH)_2D_3和ICG-001干预处理组Foxp3蛋白表达上调更加显著(P<0.01)。1,25(OH)_2D_3同ICG-001干预处理组组间比较,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。RT-q PCR结果显示TGF-β1处理细胞后,Foxp3、IL-10、IL-35的表达水平有所上调,1,25(OH)_2D_3或ICG-001干预处理后,Foxp3、IL-10、IL-35的表达水平显著上调(P<0.05)。1,25(OH)_2D_3同ICG-001干预处理组比较,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Co IP结果显示TGF-β1诱导组与对照组相比,β-catenin/Foxo1结合水平升高(P<0.05),但由于TGF-β1强大的促纤维化作用,使得β-catenin/https://www.selleck.cn/products/ABT-263.htmlTCF仍保持紧密结合。与TGF-β1诱导组相比,1,25(OH)_2D_3和ICG-001干预处理组β-catenin/High density bioreactorsTCF结合水平明显下降,β-catenin/Foxo1结合水平显著增加(P<0.05),并表明TCF、Foxo1二者竞争与β-catenin的结合,因而形成不同的转录复合物对下游靶基因进行调控。1,25(OH)_2D_3和ICG-001干预处理组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。此外采用TF ratio指标(β-catenin/TCF转录复合物versusβ-catenin/Foxo1转录复合物)分析各组转录复合物水平的差异,结果显示TF ratio指标变化趋势与Treg细胞特异性标志物Foxp3表达水平相反,说明Treg细胞的增殖活化与TF ratio水平降低密切相关。双荧光素酶报告基因实验的结果表明和对照组相比,TGF-β1诱导增强了转录因子Foxo1对下游Foxp3启动子的激活(P<0.05)。1,25(OH)_2D_3和ICG-001干预处理组与TGF-β1诱导组相比,转录因子Foxo1对下游Foxp3启动子的激活更加显著(P<0.05)。1,25(OH)_2D_3与ICG-001干预组结果相似,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1、维生素D缺乏与Treg细胞应答异常参与了哮喘的发生发展,且维生素D可能通过促进Treg细胞免疫抑制功能发挥抗炎效应,进而对哮喘产生治疗作用。2、维生素D通过调控β-catenin通路,将β-catenin关键转录因子从TCF介导的转录转移到Foxo1介导的转录,阻断β-catenin/TCF的结合,增强β-catenin/Foxo1的结合,促进Foxo1对下游Foxp3启动子的转录激活,增强Treg细胞特异性标志物Foxp3及抗炎因子的表达,从而促进Treg细胞的抗炎功能和活性,减轻免疫炎症反应。