目的:本文以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)重要毒力、致病基因PE/PPE家族基因编码蛋白成员PE22为切入点,研究PE22蛋白在MTB感染过程中发挥的作用及免疫学功能,为进一步分析MTB的致病机制提供实验依据及理论基础。方法:1.PE22蛋白的生物信息学分析及原核表达:通过Expasy Prot Param、Prot Scale、TMHMM Server v.2.0、Signal P 5.0pathologic outcomes Server、Net Phos-3.1、Cell-PLoc 2.0、SOPMA、SWISS MODEL、ABCpred、IEDB Analysis Resource、SYFPEITHI、Net MHC II pan4.0 Server、Net CTL-1.2等软件对PE22蛋白进行生物信息学分析,原核表达PE22蛋白并对其进行Western blot鉴定。2.PE22蛋白对耻垢分枝杆菌表型的影响:以纯化的PE22蛋白免疫BALB/c小鼠后获取的血清为一抗,Western blot验证电击转化法构建的能异源表达PE22蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,MS);观察构建成功的重组菌株MS-vec、MS-PE22的菌落形态及E-616452抑制剂生物膜的形成,并测定其生长曲线,初步分析重组MS的生物学特性;运用滴板法与菌落计数法(CFU)分析MS-vec及MS-PE22在孔雀绿、低p H、饥饿、H_2O_2、溶菌酶、Na NO_2、SDS等不同生存压力下的耐受性。3.PE22蛋白对巨噬细胞ANA-1功能的影响:重组菌株MS-vec及MS-PE22侵染ANA-1细胞后,抗酸染色观察重组菌侵染情况,CCK8法检测重组菌侵染ANA-1后细胞的增殖活力,Griess法检测细胞培养上清的NO含量与其涉及的信号通路,ANNEXIN V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,q RT-PCR法检测细胞i NOS、TNF-α、IL-6、IL-12p40、IL-10、IL-1β的RNA表达水平与TNF-α、IL-1β分泌所涉及的信号通路,CFU法检测重组菌株在胞内的生存能力。结果:1.PE22蛋白的生物信息学分析及原核表达:生物信息学分析显示PE22蛋白的相对分子质量为10373.77,理论等电点为6.82,由98个氨基酸组成,为结构稳www.selleck.cn/products/Decitabine定的疏水性蛋白,无跨膜区与信号肽,定位于细胞壁,含9个磷酸化位点,二级结构主要由α-螺旋构成。抗原表位预测分析显示PE22蛋白含10个线性B细胞优势抗原表位、3个构象B细胞优势抗原表位、6个Th细胞优势抗原表位与7个限制性CTL细胞优势抗原表位;菌落PCR阳性鉴定及Western blot鉴定结果显示成功构建重组质粒p ET-32a-PE22,经IPTG诱导含重组质粒p ET-32a-PE22的BL-21菌株,获得以包涵体形式表达的PE22蛋白。2.PE22蛋白对MS表型的影响:成功构建异源表达PE22蛋白的重组菌株MS-PE22,通过比较MS-vec、MS-PE22的生长及菌落形态发现,表达PE22蛋白对重组菌株的生长速率、菌落形态及生物膜形成无明显影响(P>0.05),比较MS-vec、MS-PE22在孔雀绿、低p H、饥饿、H_2O_2、溶菌酶、Na NO_2、SDS等不同生存压力下的耐受性发现,表达PE22蛋白可增强MS对H_2O_2的耐受性(P<0.05),但不改变其在孔雀绿、低p H、饥饿、溶菌酶、Na NO_2、SDS等压力条件下的耐受性(P>0.05)。3.PE22蛋白对巨噬细胞ANA-1功能的影响:抗酸染色法观察重组菌侵染细胞表明,重组菌株MS-vec及MS-PE22成功侵染ANA-1细胞,CCK8法检测不同侵染比的重组菌株侵染ANA-1后细胞的增殖活力表明,MOI为10:1时不损伤细胞的活性。与MS-vec感染组相比,MS-PE22感染的ANA-1细胞凋亡率明显降低(P<0.05),NO(P<0.001)、TNF-α(P<0.001)、IL-1β(P<0.05)及IL-12p40(P<0.05)分泌量明显增加,i NOS表达量明显增加(P<0.05),且NO、TNF-α与IL-1β分泌量可被NF-κB通路抑制剂明显抑制。比较MS-vec、MS-PE22的胞内存活率发现,MS-PE22的细胞内存活能力高于MS-vec。结论:1.PE22蛋白主要以包涵体形式表达,包含多个潜在的T、B细胞抗原表位,具有一定的免疫原性。2.PE22蛋白的异源表达可改变MS表型,增强菌株胞内生存能力,并通过促进ANA-1细胞分泌NO、TNF-α、IL-12p40、IL-1β、i NOS等免疫分子,调控巨噬细胞的免疫应答反应。