甾体类药物具有抗过敏、消炎以及调节内分泌等作用,是世界上仅次于抗生素的第二大类药物,在制药工业中占据重要地位。从头全生物合成为甾体类药物的工业生产提供了新的思路,然而由于参与各个步骤的酶活性较低、合成过程复杂等问题,阻碍了甾体类药物全生物合成的工业应用。在整个甾体生物合成途径中,细胞色素P450酶CYP11A1s扮演了至关重要的角色,其负责催化胆固醇转化成重要的甾体类药物前体孕烯醇酮。然而,CYP11A1s较低的催化活性大大限制了其在甾体类药物微生物生产中的应用。因此有必要挖掘新的CYP11A1同工酶或者Unlinked biotic predictors对CYP11A1进行酶工程改造来提高其催化活性,以促进甾体类药物或甾体类药物前体的绿色生物合成。在本研究中,为了挖掘具有胆固醇侧链切割活性的CYP11A1s,对数据库中CYP11A1s进行生物信息学分析和基因组挖掘,并在大肠杆菌中进行异源表达以及催化活性检测。之后,对其中表达水平较高的几个CYP11A1s进行了包括底物特异性以及氧化还原伴侣适配性在内的生化表征。此外,基于已知的晶体结构对人源和牛源CYP11A1s进行半理性酶工程改造,期望获得高催化活性的胆固醇侧链切割酶。主要的研究内容和结论如下:1.不同脊椎动物来源CYP11A1s的异源表达基因组数据库中存在大量的CYP11A1基因有待挖掘。以牛源CYP11A1作为模板,在蛋白数据库中进行序列比对,利用同源序列构建了 CYP11A1s的系统发育进化树。基于系统发育树,从中挑选了包括7种哺乳动物、2种鸟类以及1种鱼类在内的10个不同脊椎动物来源的CYP11A1s在大肠杆菌中进行异源表达。通过检测细胞裂解液对于胆固醇的催化活性,在mChCYP11A1(山羊,m:mature)、mBtCYP11A1(牛)、mHsCYP11A1(人)、mSsCYP11A1(野猪)、mMmCYP11A1(鼠)和mTgCYP11A1(珍珠鸟)的体外酶反应产物中检测到了催化产物孕烯醇酮,实现了 6种不同来源CYP11A1的体外催化活性重建。2.不同来源CYP11A1s的生化表征在第一部分中获得的6种具有胆固醇催化活性的CYP11A1s中,选择表达水平较高的mChCYP11A1、mBtCYP11A1、mHMLN4924说明书sCYP11A1 以及mSsCYP11A1 进行生化表征。首先,对具有膜结合性质的这4种CYP11A1s进行了蛋白纯化和体外活性检测,成功获得了具有体外催化活性的纯蛋白。之后,利用纯化的4种CYP11A1蛋白,检测了其对胆固醇、链甾醇、谷甾醇、菜油甾醇以及7-脱氢胆固醇的体外催化活性,其中野猪来源的mSsCYP11A1展现出了较好的催化活性,且4种CYP11A1s均对底物7-脱氢胆固醇具有最高的催化活性。通过分子对接对底物特异性的原因进行了解释。此外,适配的氧化还原伴侣对于P450的催化活性至关重要。在大肠杆菌中对mChCYP11A1、mBtCYP11A1、mHsCYP11A1 以及mSsCYP11A1 的本源皮质铁氧还蛋白(Adx)以及皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)进行了异源表达,利用纯化得到的蛋白进行了氧化还原伴侣的组合筛选,催化活性比较结果表明来源于野猪的mSsAdx与来源于人的mHsAdR为最佳组合。3.CYP11A1的酶工程改造为了提高CYP11A1的催化活性,对其进行了酶工程改造。首先,通过序列比对发现在底物结合口袋6 A范围内共有3个差异氨基酸,研究了这3个差异氨基酸对CYP11A1催化活性的影响。之后,基于人源和牛源CYP11A1s的晶体结构,选择位于CYP11A1的活性位点以及底物入口通道的氨基酸残基进行了丙氨酸扫描,通过对突变体进行活性筛选获得了一个催化活性提高46%的突变体mBtCYP11A1-Q377A。此外,通过测量高催化活性突变体的底物入口通道直径,发现mBtCYP11A1-Q377A的底物入口拓宽了 34%,一定程度上解释了突变体催化活性提高的原因。获得的突变体mBtCYP11A1-Q377A为CYP11A1的工程改造提供了新的候选亲本酶,也为其他真核生物P450的改造提供了参考。综上所述,本研究通过基因组挖掘来寻找具有胆固醇侧链切割活性的CYP11A1s,成功实现了 6种不同来源CYP11A1s的体外活性重建。以人源和牛源CYP11A1s作为参考,对表达水平较高的山羊来源和野猪来源的CYP11A1s进行了生化表征,山羊来源的CYP11A1对所测试的底物展现出较好的催化活性,且所有4种CYP11A1s均对7-脱氢胆固醇具有最高的催化活性,最佳的氧化还原伴侣组合为野猪来源的Adx与人源AdR。通过对CYP11A1进行酶工程改造得到了一个催化活性提高的胆固醇侧链切割酶,这对CYP11A1的工程化改造具有指导性MAPK抑制剂意义,同时也为甾体类药物的微生物生产奠定了研究基础。