研究背景食管癌(esophageal carcinoma,EC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别排第七和第六名。食管癌有两种常见的组织学类型,分别为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophaselleck合成geal adenocarcinoma,EAC),在中国主要发病类型为ESCC。目前放疗依然是ESCC的主要治疗方式,并取得了较为显著的治疗效果。但是,部分患者因为放疗反应性低而导致治疗失败,进而出现肿瘤局部复发和远处转移。因此,在深入探索影响放疗疗效的分子机制基础上,积极寻求潜在的增敏靶点和协同治疗剂等,都是国内外关注的热点和难点问题。细胞焦亡是一种依赖于 Caspase(cysteinyl aspartate specific proteinase)和 Gasdermin家族蛋白的程序性细胞死亡方式,表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,通过释放诸多细胞因子,继而激活免疫系统,导致免疫炎性反应,并参与肿瘤的发生与发展过程。发生细胞焦亡的肿瘤细胞能够增强肿瘤相关巨噬细胞的吞噬作用以及肿瘤浸润NK和CD8+T淋巴细胞的数量和功能。经典的细胞焦亡途径有炎性小体参与,伴有Gasdermin D(GSDMD)裂解和IL-1β、IL-18的释放。在非经典细胞焦亡途径中,Caspase-4/5/11的上游感知复合物缺失,这些Caspase可以不需要其他保内受体,直接与细胞内脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)结合,从而被激活。激活的 Caspase-4/5/11 也可以裂解 GSDMD,进而发生寡聚化并由细胞内转移到细胞膜上,并最终形成质膜孔。除了以上两种细胞焦亡机制外,最近有研究发现了一种新的通过GSDME介导的细胞焦亡途径:特定的刺激导致Caspase-3的激活,而之前Caspase-3通常被认作是参与凋亡的底物,活化的Caspase-3诱导Gasdermin E(GSDME)的裂解,具有打孔活性的GSDME-N端参与质膜孔的形成,也可导致细胞焦亡。X射线可以导致DNA双链断裂并导致细胞死亡,包括凋亡、坏死、自噬性死亡等。但是,细胞焦亡在ESCC放疗中的作用目前尚未有报道,是有必要进行研究的重要方向之一。安罗替尼作为我国新自主研发的一种小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI),对血管内皮细胞生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)、血小板衍生生长因子受体(platelet derived growth factor receptor,PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)、c-Kit 等靶点有着良好的抑制效果,并具有抑制肿瘤生长发展以及抗肿瘤血管生成的多重作用。安罗替尼单药在ESCC二线及以上治疗中保持Ⅱ级推荐2A类证据。同时,一项单臂、多中心探索性临床研究(ALTER-E002)数据显示,安罗替尼联合顺铂和紫杉醇的方案可以使晚期ESCC患者获益。然而,安罗替尼联合X射线在ESCC治疗中的研究较少。TKI可以使肿瘤血管正常化,改善肿瘤放疗后乏氧微环境并增加肿瘤细胞死亡。细胞焦亡作为免疫原性细胞死亡方式,发生细胞焦亡的肿瘤细胞可以促进CD8+T细胞的募集,我们通过对TCGA数据库中ESCC的RNA-seq数据分析发现,在ESCC中VEGF、FGF、PDGF的表达与Cbioactive glassD8+T细胞的浸润程度呈负相关,而安罗替尼是VEGFR、FGFR、PDGFR的多靶点抑制剂,通过阻断上述信号通路可能起到增强细胞焦亡,从而提高ESCC治疗效果的作用。根据上述理论的数据分析结果,我们推测安罗替尼联合X射线也可能具有协同治疗ESCC的作用,或者通过药物的联合应用,降低X射线的剂量,继而减少放射抵抗和副作用。本研究重点探究了细胞焦亡介导X射线或安罗替尼治疗ESCC的作用与机制,以及安罗替尼通过增强细胞焦亡发挥协同X射线治疗ESCC的作用,并取得了预期的研究结果。方法1.探究ESCC中X射线与细胞焦亡的关系及作用机制1.1 检测X射线能否引起细胞焦亡:光学显微镜观察时间梯度和剂量梯度下,X射线照射后对细胞焦亡的影响,流式细胞术和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测进细胞焦亡相关指标。利用透射电镜检测X射线照射后细胞膜打孔情况。1.2 检测GSDMs的基础表达和X射线照射后的活化:利用TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库检索Gasdermin家族蛋白在食管癌组织中的表达,并用Western blot检测ESCC细胞系中表达。NSC 125973 MWWestern blot检测ESCC细胞X射线照射后GSDMD和GSDME的活化。1.3 验证GSDME对X射线照射后细胞焦亡的影响:构建GSDME过表达和敲降细胞系,10 Gy X射线照射后利用Western blot和光学显微镜检测GSDME表达水平对ESCC细胞焦亡的影响。并利用Western blot进一步检测时间梯度和剂量梯度下,GSDME的活化。1.4 检测GSDME表达水平对ESCC放射敏感性的影响:基于剂量梯度下的克隆形成实验,利用单击多靶模型绘制生存曲线,检测GSDME对放射敏感性的影响。构建Ctrl-Eca109或shGSDME-Eca109裸鼠皮下移植瘤模型,相应组别给予X射线照射,计算肿瘤体积并绘制生长曲线;IHC检测Ki-67和DNA损伤指标γ-H2AX,在体内验证GSDME对放射敏感性的影响。1.5 临床病例组织和信息获取:收集不能耐受或者不愿选择化疗的晚期ESCC单纯放射治疗患者,治疗前的胃镜病理组织切片和临床病例相关资料。免疫组化(immunohistochemistry,IHC)评价GSDME的表达;检测ESCC患者接受单纯放射治疗3个月后的效果与GSDME表达的关系,用卡方检验来计算P值,;Kaplan-Meier曲线评估 GSDME 对 OS(Overall Survival,OS)和 PFS(Progression-free survival,PFS)的影响。1.6 鉴定GSDME上游Caspase:应用Caspase-3特异性抑制剂Z-DEVD-FMK后,检测对细胞焦亡的影响,利用Western blot进一步检测Caspase蛋白家族的活化。根据Caspase蛋白的活化情况,构建Caspase-3敲降细胞系,X射线照射后利用Western blot和LDH检测进一步验证GSDME上游调控基因。2.探索细胞焦亡在介导X射线和安罗替尼协同治疗ESCC中的作用2.1 TCGA数据库分析安罗替尼治疗靶点相关因子:从TCGA数据获取ESCC的RNA-seq数据,单个相关性图通过R软件包ggstatsplot实现,使用Spearman的相关分析来描述相关性。2.2 检测安罗替尼对ESCC细胞生物学功能的影响:利用CCK-8细胞增殖曲线和EdU实验检测安罗替尼对ESCC细胞增殖的影响。Transwell实验用于检测ESCC细胞的迁移、Western blot 检测上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关分子表达,评估安罗替尼对ESCC细胞侵袭和迁移的影响。2.3 体外探索安罗替尼在ESCC中与X射线的协同作用:将ESCC细胞分为对照组、安罗替尼处理组、单纯X射线照射组和安罗替尼联合X射线照射组(以下简称联合治疗组)四组,分别给予不同处理后,克隆形成实验用于检测ESCC细胞的克隆形成能力,反映细胞增殖水平,免疫荧光和Western blot检测γ-H2AX和修复蛋白p-BRCA1。并根据克隆形成实验结果构建Bliss独立模型,评估安罗替尼在体外与X射线的协同作用。2.4 构建ESCC裸鼠皮下移植瘤模型:分别给予X射线照射和安罗替尼处理不同模式组合处理,根据肿瘤体积绘制移植瘤生长曲线,比较联合治疗组的治疗效果;IHC验证Ki-67和γ-H2AX的表达。并根据肿瘤生长情况构建Bliss模型,体内验证安罗替尼与X射线的协同作用。2.5 检测安罗替尼能否引起ESCC细胞焦亡:光学显微镜观察并记录安罗替尼处理后ESCC细胞焦亡典型特征,使用流式细胞术和透射电镜进一步验证。Western blot用于检测细胞焦亡相关指标的活化水平。2.6 检测安罗替尼联合X射线对细胞焦亡的影响:光学显微镜和流式细胞术检测联合治疗后ESCC细胞焦亡情况,Western blot进一步检测各组细胞焦亡相关指标的活化水平。2.7 临床病例组织和信息获取:收集ESCC原发患者的手术肿瘤组织标本,Western blot和IHC评估GSDME的表达;卡方检验用于分析GSDME表达与各临床特征之间的关系;生存曲线利用Kaplan-Meier法分析绘制,评估GSDME表达对OS的影响;单因素和多因素分析基于Cox比例风险模型进行,评估GSDME能够用于预测ESCC患者的预后。结果1.X射线对ESCC细胞焦亡的影响及作用机制1.1 X射线能够诱导ESCC细胞焦亡:在10 Gy X射线照射后96 h,ESCC细胞发生明显的吹泡现象,LDH释放增加,指示细胞焦亡的碘化丙啶(propidium iodide,PI)和膜联蛋白(Annexin V)双阳性的细胞逐渐增多,透射电镜显示细胞胀大,细胞膜完整性被破坏,细胞焦亡孔道形成。证实X射线能够诱导ESCC细胞焦亡,并呈时间依赖性和剂量依赖性,高剂量引起的细胞焦亡更明显。1.2 GSDME介导X射线引起的ESCC细胞焦亡:根据TCGA数据库和Western blot检测Gasdermin家族蛋白结果显示,GSDMD和GSDME在ESCC中表达。10 Gy X射线照射后96 h,GSDME明显活化。构建GSDME过表达和敲降细胞系,细胞形态和Western blot结果显示GSDME表达和ESCC细胞焦亡程度呈正相关。1.3 GSDME的表达水平与ESCC放射敏感性相关:基于梯度剂量X射线的照射下,进行克隆形成实验,构建单击多靶模型并绘制生存曲线结果显示,GSDME表达水平与放射敏感性呈正相关。体内实验证实,相比于对照组,GSDME敲降组X射线照射后移植瘤的生长速度更快,体积更大,并且Ki-67表达增多,γ-H2AX表达减少,敲降GSDME能够降低裸鼠移植瘤的放射敏感性。1.4 GSDME的表达水平与ESCC患者的放疗反应性和预后相关:疗效评估和生存分析结果显示,GSDME的表达影响ESCC单纯放疗患者的疗效和预后。1.5 X射线通过激活Caspase-3活化GSDME,介导ESCC细胞焦亡:应用Caspase-3特异性抑制剂Z-DEVD-FMK结果显示GSDME的活化受抑制,提示GSDME的活化可能受上游Caspase-3的调控。Western blot结果显示,X射线照射后Caspase-3发生活化。对Caspase-3敲降后进行X射线照射,结果显示,X射线能够通过激活Caspase-3活化GSDME,介导ESCC细胞焦亡。2.细胞焦亡介导X射线和安罗替尼协同治疗ESCC的作用2.1 TCGA数据库分析安罗替尼治疗靶点相关因子:TCGARNA-seq数据分析结果显示,安罗替尼治疗靶点相关因子VEGF、FGF、PDGF的表达与CD8+T细胞浸润呈负相关。2.2 安罗替尼抑制ESCC恶性表型:CCK-8和EdU实验结果显示,安罗替尼可以抑制ESCC细胞增殖;transwell实验和Western blot检测EMT相关分子结果显示,应用安罗替尼后,ESCC细胞侵袭迁移能力减弱。2.3 体外探索安罗替尼在ESCC中与X射线的协同作用:克隆形成结果显示,与单用安罗替尼和X射线照射组相比,联合治疗组对ESCC细胞克隆形成能力抑制增加,反映细胞增殖能力降低。Bliss模型结果显示,安罗替尼与X射线在ESCC中存在协同作用。免疫荧光和Western blot检测γ-H2AX和p-BRCA1结果显示,联合治疗组DNA损伤增加,修复减少。上述结果显示安罗替尼能够在体外协同X射线增强ESCC的治疗效果。2.4 体内验证安罗替尼在ESCC中与X射线的协同作用:BALB/c裸鼠皮下成瘤实验结果显示,应用安罗替尼可以增强放疗反应性,移植瘤的生长速度减慢,体积减小。并且Ki-67阳性细胞减少、γ-H2AX表达增多。Bliss独立模型结果显示,安罗替尼能够在体内协同X射线增强ESCC的治疗效果。2.5 安罗替尼能够诱导ESCC细胞焦亡:光学显微镜观察、流式细胞术检测以及透射电镜结果显示,应用1 μM安罗替尼48 h后可以观察到细胞焦亡的发生。Western blot检测细胞焦亡相关蛋白结果显示安罗替尼能够导致GSDME的活化,诱导ESCC发生细胞焦亡。2.6 安罗替尼能够通过GSDME介导的细胞焦亡增强ESCC放疗反应性:细胞形态变化和流式细胞术结果显示,联合治疗组6 Gy/48 h的细胞焦亡即可明显增多。Western blot检测细胞焦亡相关蛋白显示,安罗替尼能够通过GSDME介导的细胞焦亡增强ESCC放疗反应性。2.7 GSDME的表达水平与ESCC患者的预后相关:ESCC患者的手术肿瘤组织切片的IHC染色结果显示,不同患者之间GSDME的表达存在差异,高表达组的病例数为68例,而低表达组的病例数为47例;Kaplan-Meier曲线显示GSDME高表达组的OS更好,单因素和多因素分析结果显示GSDME可以用于预测ESCC患者的预后。结论1.细胞焦亡是介导X射线、安罗替尼,或者两者协同作用的重要共性机制途径。2.X射线通过激活Caspase-3,继而活化GSDME介导ESCC的细胞焦亡。3.GSDME的表达水平影响ESCC放射敏感性,并与ESCC单纯放疗患者的疗效和预后呈正相关。4.安罗替尼抑制ESCC恶性表型,并与X射线在ESCC中发挥协同治疗作用。5.安罗替尼能够诱导细胞焦亡,并且能够通过GSDME介导的细胞焦亡增强ESCC的放疗反应性。6.GSDME低表达与ESCC患者的不良预后相关。