研究背景我国恶性肿瘤发病率高、且呈现逐年上升的趋势。近年来研究发现,肿瘤的发生常伴随着免疫微环境的异常。肿瘤免疫微环境组成复杂,其中微环境内的代谢产物和细胞因子等能够重塑免疫细胞的表型与功能,抑制其抗肿瘤能力,甚至发挥促肿瘤作用,导致肿瘤免疫逃逸。因此,近些年来免疫治疗已逐渐成为临床肿瘤综合治疗的重要方案之一。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝脏最常见的恶性肿瘤,在全球的恶性肿瘤发生率中占第六位,位居世界范围内癌症致死率第三位,严重危害人类健康,且对免疫治疗响应性差。肝脏富含巨噬细胞,肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是肝癌免疫微环境的重要组成部分,具有高度的可塑性和异质性,在决定肝癌发生发展和临床免疫治疗响应性中发挥重要作用。因此,进一步揭示TAMs表型和功能的调控机制,将为阐明HCC发病机理、发现新的肿瘤干预靶点提供实验依据。巨噬细胞具有表型可塑性和功能多样性,分为M1型经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophage)和 M2 型替代性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophage)以及两者之间的众多过渡类型。同样,TAMs也可以分为M1型和M2型。其中,M2型TAMs与肿瘤的发生发展和较差的患者预后密切相关。众多代谢途径参与调控巨噬细胞的表型分化和功能重塑,例如脂质代谢重编程在其中就发挥重要作用。已有研究表明M1型巨噬细胞主要依靠有氧糖酵解消耗葡萄糖以及消耗谷氨酰胺来产生ATP,而M2型巨噬细胞则主要依赖脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)作为ATP来源。线粒体作为细胞有氧呼吸的主要场所,参与调节TAMs的脂质代谢水平并影响其功能的发挥,进而影响肿瘤的发生发展。然而,越来越多的证据表明,对于细胞内长链脂肪酸的氧化还需要另一种细胞器,即过氧化物酶体的作用。长链脂肪酸经过过氧化物酶体的初步氧化剪切后,再将获得的短链脂肪酸以酰基辅酶A的形式转输到线粒体中进行进一步的β循环氧化。然而,目前关于过氧化物酶体在巨噬细胞表型和功能调控中的作用尚不明确。本课题以巨噬细胞作为研究对象,发现IL-4诱导的M2型巨噬细胞中脂质富集水平发生上调,且这样的脂质异常富集与线粒体和过氧化物酶体的FAO密切相关。由于TAMs脂质代谢异常与患者更差的预后相关,所以我们进一步以TAMs为研究对象,通过体外实验以及肝癌患者的样本分析后验证了 M2型TAMs中亦存在脂质异常富集的现象,并且线粒体和过氧化物酶体FAO代谢与TAMs的M2表型的维持有关。综上,我们研究了线粒体和过氧化物酶体介导的脂肪酸氧化在调控M2型巨噬细胞与TAMs的脂质水平、表型和功能中的作用,为阐明巨噬细胞代谢重塑机制、寻找干预TAMs促肿瘤功能的潜在靶点提供了新的依据。研究方法与结果1.M2型巨噬细胞中脂质富集水平上调脂质代谢在巨Biofertilizer-like organism噬细胞表型和功能调控中发挥重要作用,我们首先以mIL-4(20ng/ml)刺激小鼠的巨噬细胞系RAW264.7,或以hIL-4和hIL-13(20ng/ml)刺激人的单核细胞系THP1后,RT-qPCR验证RAW264.7细胞中M2极化相关标志分子Arg1和Tgf-β和THP1细胞中的CD206、TGF-β和IL-10的表达上调,确定成功诱导M2样巨噬细胞表型。利用中性脂质染料BODIPY染色后,荧光显微镜观察和流式细胞术检测胞内脂质富集情况,结果显示与对照细胞相比,两种M2型巨噬细胞中脂质富集水平均显著上调。同时,以IL-4诱导小鼠原代巨噬细胞(小鼠骨髓来源的巨噬细胞BMDMs和腹腔巨噬细胞PEMs),RT-qPCR验证其M2表型,流式细胞术检测脂质富集水平,结果显示M2型BMDMs和PEMs中脂质富集水平显著高于未selleck激酶抑制剂刺激组细胞。上述结果提示,M2型巨噬细胞中脂质富集水平显著上调。2.M2型巨噬细胞中线粒体和过氧化物酶体FAO相关基因表达上调线粒体和过氧化物酶体是参与细胞FAO代谢的主要细胞器,因此我们进一步检测了 M2型巨噬细胞中线粒体和过氧化物酶体FAO通路相关基因的表达情况。RT-qPCR结果显示,经IL-4刺激的BMDMs和PEMs中线粒体FAO代谢相关酶Cpt1a、Crat和Acads和过氧化物酶体FAO代谢相关酶Acot4、Acot8、Ehhadh和Acox-1的表达均较未刺激组细胞上调。Western Blot实验在蛋白水平进一步证明了 IL-4刺激的PEMs中线粒体FAO限速酶CPT1A和过氧化物酶体FAO限速酶ACOX1均明显上调表达。这些结果提示M2型巨噬细胞中线粒体和过氧化物酶体的FAO通路可能被激活。3.阻断线粒体和过氧化物酶体FAO通路进一步上调M2型巨噬细胞中脂质富集水平为进一步验证线粒体和过氧化物酶体FAO代谢通路在M2型巨噬细胞脂质代谢调控中的作用,我们利用线粒体FAO限速酶CPT1A的抑制剂Etomoxir和过氧化物酶体FAO限速酶ACOX1的抑制剂TDYA,分别处理IL-4刺激的BMDMs和PEMs,BODIPY染色、流式细胞术检测细胞内脂质富集情况。结果显示,Etomoxir和TDYA处理均可显著上调BMDMs和PEMS中脂质富集水平,提示线粒体和过氧化物酶体可能参与了M2型巨噬细胞的脂质分解代谢。4.干扰线粒体和过氧化物酶体FAO通路能够抑制M2型巨噬细胞表型和功能脂质代谢在巨噬细胞表型调控中发挥重要作用,为进一步明确线粒体和过氧化物酶体的FAO通路是否参与调控M2型巨噬细胞的极化表型。我们检测了 Etomoxir和TDYA处理对巨噬细胞表型的影响,RT-qPCR结果显示Etomoxir和TDYA处理显著下调IL-4刺激的BMDMs和PEMs中M2型巨噬细胞标志分子Arg1和Ym1的表达水平。流式细胞术数据也证明了 Etomoxir和TDYA处理能够下调BMDMs和PEMs中M2样表型分子的表达。上述结果提示,线粒体和过氧化物酶体的FAO通路可能参与调控M2型巨噬细胞的表型。众多研究显示,M2型巨噬细胞在肿瘤进程中发挥促肿瘤的作用。因此,我们进一步探究Etomoxir和TDYA处理后的M2型巨噬细胞是否还具有促进肝癌细胞增殖的功能。分别收取Etomoxir和TDYA处理后的M2型巨噬细胞上清,刺激小鼠肝癌细胞系Hepa1-6。CCK8细胞增殖实验数据显示,与对照M2型巨噬细胞来源的上清相比,Etomoxir和TDYA处理在一定程度上抑制了 Hepa1-6细胞的增殖。上述结果初步提示,干扰M2型巨噬细胞线粒体和过氧化物酶体FAO通路能够抑制其促肿瘤表型。5.肝癌相关巨噬细胞中脂质明显富集肿瘤微环境能够重塑TAMs的表型和功能,介导肿瘤免疫逃逸,促进疾病进程。已知TAMs主要极化为促肿瘤的M2表型,因此课题进一步验证了 TAMs中脂质富集情况。首先建立了肿瘤细胞与巨噬细胞的体外共培养体系,BODIPY染色、荧光显微镜观察和流式细胞术结果显示分别与人的肝癌细胞系Huh7或小鼠的肝癌细胞系Hepa1-6细胞共培养的THP1和RAW264.7细胞中脂质的富集水平显著上调。RT-qPCR和流式细胞术验证与Hepa1-6共培养的小鼠原代巨噬细胞(小鼠骨髓来源的巨噬细胞BMDMs和腹腔巨噬细胞PEMs)M2表型相关标志物Arg1和Ym1表达上调,同时用流式细胞术检测脂质富集水平,结果显示与肝癌细胞共培养后的BMDMs和PEMs中脂质富集水平显著高于未刺激组细胞。同时,借助于拉曼光谱检测技术结合免疫荧光染色对肝癌患者癌与癌旁组织中TAMs的脂质水平进行了定量分析。结果发现,与癌旁组织巨噬细胞相比,肝癌组织TAMs的脂质富集水平显著增加。上述结果提示肿瘤微环境能够上调巨噬细胞中脂质富集水平。6.线粒体和过氧化物酶体参与调控肝癌相关巨噬细胞的FAO代谢途径BODIPY标记的中性脂质主要定位于脂滴中,而脂滴与其他细胞器互作参与细胞内脂质代谢调控,因此我们观察了 TAMs中脂质与线粒体、过氧化物酶体的定位情况。将THP1细胞与Huh7细胞共培养后,激光共聚焦显微镜观察显示,脂质的BODIPY荧光与MitoTracker Deep Red标记的线粒体、特征性膜蛋白PMP70标记的过氧化物酶体存在共定位,提示线粒体和过氧化物酶体可能参与了 TAMs的脂质代谢。为明确线粒体和过氧化物酶体FAO通路在TAMs中的变化,我们进一步检测了肝癌细胞共培养对BMDMs和PEMs中FAO相关基因表达的影响,RT-qPCR结果显示肝癌细胞共培养能够显著上调BMDMs和PEMs中线粒体FAO代谢相关酶Cpt1a、Crat和Acads以及过氧化物酶体FAO代谢相关酶Acot4、Acot8、Ehhadh和Acox1的表达。同时蛋白水平检测发现PEMs在与Hepa1-6共培养后线粒体FAO限速酶CPT1A和过氧化物酶体FAO限速酶ACOX1均表达上调。上述结果提示,TAMs中线粒体和过氧化物酶体的FAO通路被激活。7.阻断线粒体和过氧化物酶体FAO通路进一步促进肝癌相关巨噬细胞中的脂质富集为进一步验证线粒体和过氧化物酶体FAO通路在TAMs脂质代谢中的作用,Etomoxir和TDYA处理与肝癌细胞共培养的BMDMs和PEMs细胞,BODIPY染色、流式细胞术检测脂质富集情况。结果显示,Etomoxir和TDYA处理能够显著上调与肝癌细胞共培养的BMDMs和PEMs的脂质富集水平,提示线粒体与过氧化物酶体FAO通路均参与TAMs中脂质代谢过程。8.抑制线粒体和过氧化物酶体FAO通路调控TAMs表型为验证线粒体和过氧化物酶体FAO通路在TAMs的表型重塑中的作用,我们检测了 Etomoxir和TDYA处理对TAMs表型的影响。结果显示,经Etomoxir和TDYA处理后的BMDMs来源的TAMs中M2表型标志分子表达明显下调,提示线粒体和过氧化物酶体FAO通路均参与了 TAMs细胞M2样表型重塑过程。研究结论与意义脂质代谢在巨噬细胞表型和功能重塑中发挥重要的调控作用,而FAO通路为M2样巨噬细胞能量的主要来源之一。本课题以IL-4活化的M2型巨噬细胞和TAMs为研究对象,检测了上述巨噬细胞中脂质富集以及线粒体和过氧化物酶体FAO通路的变化,初步探索了线粒体和过氧化物酶体FAO通路在巨噬细胞表型和功能调控中的作用。Rapamycin分子量研究发现M2型巨噬细胞和TAMs中脂质富集增加伴随线粒体和过氧化物酶体FAO通路相关基因的表达上调,而阻断线粒体和过氧化物酶体FAO通路能够进一步上调巨噬细胞中脂质富集水平、同时抑制M2样巨噬细胞表型。我们的研究为阐明肿瘤微环境中巨噬细胞代谢重塑机制提供了新的实验依据,为寻找巨噬细胞免疫治疗相应靶点提供了新思路。