缺氧是肿瘤微环境中一种普遍而重要的现象。它的发生主要源自于组织内氧气供应与消耗之间的不均衡。而缺氧微环境又会作用于肿瘤细胞导致肿瘤细胞的代谢异常,同时也诱导肿瘤组织产生相应的治疗抵抗作用。在肿瘤放疗方面,研究发现如果肿瘤组织的氧分压降低到25～30 mm Hg以下,细胞的放疗敏感性会显著降低,这可能与热休克蛋白表达水平的增加或凋亡相关基因表达量的减少有关。在肿瘤化疗方面,许多化疗药物(如卡莫司汀和烷基化剂)的抗肿瘤效果高度依赖肿瘤组织中的氧含量。缺氧诱导的耐药机制十分复杂,其中涉及肿瘤生物力学等物理特性因素、肿瘤生长转移水平、肿瘤恶性进展进程、细胞自噬与衰老、以及低氧诱导基因对抗癌药物的耐药诱导等。另外,光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)作为一种肿瘤治疗的新兴方法,其关键在于通过特定波长的光激发光敏剂(Photosensitizer,PS),随后PS将能量传递给周围组织中的氧分子,产生高细胞毒性的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),并有效清除癌细胞。然而,当肿瘤组织氧分压降低至13至35 mm Hg时,治疗效果将显著降低。综上所述,肿瘤组织缺氧极大地限制了化疗、放疗、PDT等依赖氧气的治疗策略的疗效。因此,克服缺氧是增敏实体肿瘤化疗、PDT等疗效的重要策略。血红蛋白氧载体(Hemoglobin Based Oxygen Carriers,HBOCs)是一种基于血红蛋白人工设计的氧载体,可作为改善组织供氧的增氧剂,有效地解决肿瘤组织微环境缺氧的问题。Teicher团队证明超纯化聚合牛血红蛋白溶液可以增强放疗和化疗的有效性,同时缓解肿瘤缺氧。Luo等人利用蛋白杂交技术,将人血浆中的白蛋白与血红蛋白结合,制备了一种杂交蛋白氧载体。研究结果表明,该氧载体能够有效提高肿瘤组织的氧分压,并且能够增强光动力疗法的治疗效果。然而,HBOCs氧亲和力的不同对肿瘤组织供氧的效果与影响尚无统一定论。半氧饱和度分压,又叫P_(50)值(The P_(50) value,P_(50)),是用来评价HBOCs氧亲和力的重要指标,高P_(50)表明血红蛋白氧亲和力低,容易释放氧气,不利于体内氧气的长效运输;低P_(50)表明氧亲和力高,易于结合与运输氧气,却不利于向组织释氧。对肿瘤组织而言,供氧不足则无法缓解治疗的抵抗作用;提升HBOCs对肿瘤的供氧与HBOCs的氧亲和力关系密切。多数研究认为:低氧亲和力HBOCs更趋向于释氧,可以更有效改善肿瘤缺氧;也研究提出:高氧亲和力HBOCs可能可以避免在循环系统中的氧气无效释放,更高效地将HBOCs的结合氧释放进缺氧组织中。针对HBOCs氧亲和力是否影响肿瘤组织缺氧的改善,以及不同氧亲和力HBOCs的适宜给药方式与场景问题尚有争论,对此,需要针对不同供氧策略,研究不同氧亲和力的HBOCs对肿瘤缺氧微环境的改善、缓解治疗抵抗作用的差异、及其分子机制。需要重点阐明以下问题:1)研究高氧亲和力的HBOCs是否对肿瘤组织缺氧具有改善作用;2)通过调控血红蛋白氧亲和力,构建不同氧亲和力的HBOCs,为实现不同增氧治疗策略奠定基础;3)建立细胞与动物模型,明确不同氧亲和力HBOCs对肿瘤的增氧效果以及对相关治疗的增敏效果的影响,例如:化疗、光动力治疗等,对不同氧亲和力HBOCs的肿瘤增氧增敏治疗效果进行比较研究,并阐明相关作用机制。针对上述问题本研究设计并分为以下三个部分。第一章聚乙二醇偶联牛血红蛋白应用于肿瘤增氧增敏阿霉素化疗效果并缓解器官损伤的研究为了研究高氧亲和力HBOCs释氧能否确切改善肿瘤组织缺氧,增敏化疗药物的抗肿瘤疗效,并关注在使用HBOCs增强化疗时,是否具有缓解化疗药对主要器官的副作用,研究设计使用一种制备成熟的HBOCs,即聚乙二醇偶联的牛血红蛋白(PEG-conjugated bovine hemoglobin,PCBH)改善肿瘤组织的缺氧状态,联合化疗药阿霉素(Doxorubicin,DOX)实施肿瘤阶段性供氧增敏化疗的策略。并通过建立荷瘤裸鼠模型,对肿瘤进行增敏化疗,探讨高氧亲和力的PCBH增敏DOX的抗肿瘤效果以及确认PCBH在缓解DOX诱导的心脾毒性方面是否发挥显著作用。Gefitinib-based PROTAC 3 molecular weight1)实验设计四组动物实验分组,分别为:NS组、PCBH组、DOX组与DOX+PCBH联合给药组(增敏组);瘤内注射上述药品。发现高氧亲和力的PCBH对缺氧肿瘤组织的增氧效果得到验证,相较于DOX组与NS组,PCBH显著下调肿瘤组织的HIF-1表达,增敏组HIF-1表达仅为NS组的33.22%,PCBH组表达为NS组的32.47%。2)在细胞水平和动物水平上,高氧亲和力的PCBH通过释氧增敏DOX的肿瘤杀伤效果得到验证,即PCBH可以通过下调HIF-1表达降低化疗药物外排泵P-gp的表达,相较于DOX组与NS组,增敏组DOX的肿瘤有效杀伤得到显著增强,增敏组的肿瘤抑制达到87.3%,肿瘤组织坏死率达62.36±10.70%。3)考察了PCBH通过其释氧能力改善肿瘤血管新生,降低肿瘤的肺转移效果,实验验证相对于NS与DOX组,含有PCBH的分组肿瘤组织新生血管显著减少,DOX-PCBH组VEGF、CD31、CD34的表达分别是NS组表达量的51.23%、52.18%、43.66%;PCBH也可下调VEGF、CD31、CD34的表达,分别是NS组表达量的71.18%、76.75%、60.53%。另外,PCBH组和增敏组的肿瘤肺转移灶数量明显低于NS组,这表明PCBH释放的氧气snail medick显著改善了肿瘤组织的缺氧情况,下调血管新生标志物蛋白的表达水平,从而减少了肿瘤转移的风险。4)考察了PCBH对肿瘤和DOX所带来的心脾毒性的缓解作用。实验发现PCBH显著降低了肿瘤诱导以及DOX诱导的心肌纤维化与心肌细胞凋亡,抑制脾淋巴细胞数量与密度的减少与脾小结的萎缩。第二章血红蛋白氧亲和力调控与多肽水凝胶包裹牛血红蛋白纳米氧载体的制备与表征第一章研究证实相对游离牛血红蛋白,氧亲和力较高的PCBH具有显著的肿瘤增氧特性,为了继续对不同氧亲和力的HBOCs进行比较研究,在本研究中,我们应用血红蛋白别构效应剂(GBT440和RSR-13),调控血红蛋白氧亲和力,并使用一种肽基支架材料,在常温条件下加入蛋白触发多肽水凝胶的自组装,形成交联纳米纤维。通过将肽溶液和牛血红蛋白(Bovine Hemoglobin,b Hb)简单混合,被调控后的b Hb可以被包裹在三维纳米纤维中,并形成稳定的水凝胶结构。本章节研究别构效应剂对b Hb的氧亲和力的影响,评价封装b Hb水凝胶的形态学性质、微观结构、以及对封装b Hb的释氧能力影响。1)本研究考察了两种别构效应剂(GBT440、RSR-13)对b Hb的变构效应,并发现随着别构效应剂与b Hb的摩尔浓度比升高,b Hb的氧亲和力发生显著改变。无论调控作用为提高氧亲和力或是降低氧亲和力,均在不同剂量下显示了剂量依赖效应,实验精准调控了血红蛋白的携氧/释氧能力,并稳定调控出P_(50)从54.57±3.26 mm Hg至7.61±1.08 mm Hg的调控血红蛋白。2)通过b Hb蛋白激发多肽水凝胶成胶,成功制备并初步表征了多肽水凝胶包裹血红蛋白氧载体纳米。成胶效果显著,多肽形成了明显粗长、具有多孔、有序且密集的纤维结构。3)多肽水凝胶容易在液体环境中解聚并释放其负载物,因此依赖液体环境进行检测的携氧/释氧分析仪无法准确检测水凝胶环境中的调控血红蛋白的释氧能力。为克服这个问题,本实验创新性地拓展出了一个动态氧环境检测血红蛋白释氧速度的实验方案。该方案可在96孔板中实现样品的高通量检测,并能近似模拟在机体内,HBOCs从高氧含量组织到低氧含量组织的释氧过程。4)本实验考察了多肽水凝胶包封b Hb对其相关影响。实验结果表明,多肽水凝胶未遮蔽b Hb的光谱特征峰,并通过动态氧环境监测释氧实验方案验证:多肽水凝胶未对别构效应剂的b Hb氧亲和力的调控产生影响,即多肽凝胶保留了调控血红蛋白的携氧/释氧能力以及相关调控趋势。第三章调控血红蛋白联合Ce6凝胶平台应用于增敏光动力治疗的研究本章研究在第一二章的基础上,利用PDT高度依赖肿瘤组织氧的特性,通过细胞与动物水平,对比研究不同氧亲和力HBOCs对缺氧肿瘤的增氧效果差异与PDT增敏差异。研究通过引入可生物降解多肽水凝胶作为药物承载系统,以实现调控血红蛋白和光敏剂的整合调控以及在肿瘤组织部位的长效聚集。1)本实验研究了三种调控血红蛋白氧亲和力的b Hb(P_(50)分别为43±2.5 mm Hg、24±1.3 mm Hg和7±1.5 mm Hg)在不同释氧时间后对4T1细胞的光动力增敏效应。结果显示,不同P_(50)的b Hb在缺氧环境下完全释氧的时间不同。提示:高P_(50)(RSR-13调控)b Hb释氧时间短,需在短时间内完成细胞增氧和PDT杀伤;低P_(50)(GBT440调控)b Hb释氧时间长,与上述现象相反,差异具有显著性。2)本实验评估了各调控组对肿瘤细胞增氧水平的影响LGX818使用方法,通过检测增氧6 h后各调控组细胞的HIF-1表达水平并进行定量分析。实验结果显示,相较于缺氧组,各调控组均能显著下调HIF-1α的表达。值得注意的是,随着b Hb氧亲和力的升高,HIF-1α的表达下降程度也显著增强。3)本实验研究了三种P_(50)的b Hb在6 h内对PDT增敏作用,并通过对4T1细胞凋亡的检测来评估增敏效果。结果表明,三组增敏组通过增氧,增加细胞氧含量,在接受光照之后,激发出ROS,对细胞进行杀伤和凋亡诱导,细胞凋亡通路包括线粒体通路。在缺氧环境中,不同P_(50)的b Hb对PDT增敏的时间产生影响,在较长的释氧时间内,GBT440调控组细胞凋亡比达68.41±1.55%,显著高于其他增敏组。此外随着各调控b Hb的氧亲和力的提高,各增敏组细胞的凋亡程度逐渐加深。4)通过多肽水凝胶包裹血红蛋白氧载体纳米,对动物荷瘤模型进行肿瘤增氧增敏PDT治疗,实验发现各增敏组肿瘤生长均得到显著抑制,肿瘤抑制率达56.3%。同时,研究显示在相同的肿瘤组织内增氧时间(6 h)下,不同的增敏组对肿瘤杀伤效果不同,HE病理分析显示GBT440调控增敏组与b Hb增敏组的肿瘤坏死率分别为43.8%与41.2%,显著高于RSR-13调控增敏组的17.8%,提示其PDT杀伤更彻底。综上,本研究验证了HBOCs对肿瘤组织的缺氧改善作用,并进一步比较了具有不同氧亲和力的HBOCs对肿瘤组织增氧效果及其对化疗、PDT影响的差异。结合裸鼠异种移植模型以及模拟缺氧细胞模型,明确了高/低氧亲和力b Hb在缺氧环境中以及模拟体内循环时的释氧速度。研究表明,高氧亲和力的HBOCs携氧能力强,能够在极度缺氧环境(1.0%O_2)中缓慢释放氧气,从而改善肿瘤组织缺氧情况,增强氧气依赖性的肿瘤治疗,提示高氧亲和力HBOCs由于在缺氧环境中释氧缓慢,更有利于对化疗等需要长效增氧的治疗进行增敏辅助治疗。