单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)简称单增李斯特菌,是一种革兰氏阳性细菌,属厚壁菌门,李斯特菌属。LM作为一种极其重要的人兽共患食源性致病菌,可引发人和多种动物患李斯特菌病(Listeriosis)。LM能够成功侵入宿主细胞主要由第一毒力岛编码的毒力因子介导,这些毒力因子包括内化素A(Internalin A,InlA)、内化素B(Internalin B,InlB)、肌动蛋白聚集因子(ActA)、溶血素O(Listeriolysin O)、金属蛋白酶(Mpl)以及两种溶脂酶(PlcA和PlcB)等。上述主要毒力因子均需通过分泌系统转运至细菌胞外并锚定在细菌表面或以游离形式存在于菌体之外。前期研究显示,InlB锚定异常显著减弱LM的感染能力和致病力。文献报道显示InlB以非共价键形式锚定于LM细胞壁的磷壁酸上。在4b血清型菌株中,壁磷壁酸(WTAs)的半乳糖基化修饰缺失会显著降低InlB的锚定量。WTAs的半乳糖基化可能由GalE、GalU、GtcA、GttA和GttB等糖基转移酶完成,然而仅GttA和GttB的编码基因特异性存在于4b血清型菌株中,GalE、GalU和GtcA的编码基因则保守存在于各种血清型LM菌株中。目前尚不清楚GalE对LM细胞壁WTAs修饰以及InlB锚定的影响。因此,本研究旨在探明LM糖基转移酶GalE在InlB锚定过程中的作用及其分子机制,为进一步探究LM的致病机制提供线索。1、GalE介导LM ScottA菌株的致病性首先利用同源重组技术构建4b血清型galE基因缺失株,并利用表达质粒构建galE基因回补株。然后通过最小抑菌试验评估galE基因缺失是否影响LM对抗生素的敏感性;通过Western blot分析InlB等主要毒力因子在亲本株和galE基因缺失株表面的锚定情况;利用细胞粘附侵袭试验和小鼠毒力试验评估galE基因缺失对LM感染能力和致病性的影响。首先以4b血清型菌株ScottA为亲本株成功构建了galE基因缺失株(ScottA-ΔgalE)和回补株(CΔgalE)。生长试验显示,galE基因缺失不影响LM在BHI培养基中的生长能力。最小抑菌浓度试验显示galE基因缺失不影响LM对青霉素和氨苄青霉素的敏Talazoparib生产商感性。粘附侵袭试验显示galE基因缺失导致ScottA-ΔgalE菌株对肠上皮细胞Caco-2的粘附侵袭能力显著低于亲本株ScottA,回补株CΔgalE对Caco-2的粘附侵袭能力则与亲本株ScottA相当。Western blot结果显示galE基因缺失株ScottA-ΔgalE表面锚定的InlB显著低于亲本株ScottA,培养上清中的InlB含量则显著高于亲本株,回补株CΔgalE与亲本株ScottA的InlB分布则无显著性差异。小鼠毒力试验显示腹腔注射感染后48小时,基因缺失株ScottA-ΔgalE在小鼠肝脏、脾脏和脑中的细菌载量均显著低于亲本株ScottA,亲本RAD001细胞培养株与回E coli infections补株在感染小鼠脏器中的细菌载量则无显著性差异;ScottA-ΔgalE感染组小鼠的存活率显著高于亲本株和回补株感染组。病理切片分析结果显示,基因缺失株ScottA-ΔgalE感染组小鼠的肝脏、脾脏和脑组织中的炎性细胞浸润程度显著低于亲本株和回补株感染组。进一步通过分析GalE在1/2a,1/2b,1/2c和4a血清型菌株中对InlB锚定和LM毒力的影响,阐明GalE介导InlB锚定和LM致病力可能的机制。2、糖基转移酶GalE对LM内化素B锚定的影响进一步以1/2a血清型菌株EGDe、1/2b血清型菌株Hum Lm6、1/2c血清型菌株Hum Lm4和4a血清型菌株850658-prfA_(M7)为亲本株构建了galE基因缺失株。最小抑菌浓度试验结果表明galE基因缺失除1/2a血清型EGDe菌株外,均不影响其它血清型菌株对青霉素和氨苄青霉素的敏感性。Western blot试验结果显示galE基因缺失导致InlB在1/2a血清型菌株EGDe和4a血清型菌株850658-prfA_(M7)表面的锚定量显著降低,但显著上调InlB在1/2c血清型菌株Hum Lm4表面的锚定量。毒力试验结果显示galE基因缺失可以显著降低1/2a血清型菌株EGDe和1/2c血清型菌株Hum Lm4在感染小鼠脾脏中的载菌量,但不影响其在感染小鼠肝脏中的载菌量。综上所述,本研究构建了galE基因缺失株和回补株,通过生长试验和最小抑菌浓度试验表明galE基因缺失不影响LM的生长能力和对靶向细胞壁的青霉素和氨苄青霉素的敏感性。但galE基因缺失显著降低InlB在4b血清型菌株表面的锚定能力,显著减弱LM对肠上皮细胞的粘附侵袭能力以及对小鼠的致病力。在1/2a血清型菌株EGDe、1/2c血清型菌株Hum Lm4和4a血清型菌株850658-prfA_(M7)中,galE基因缺失对LM表面InlB的锚定及其致病性与4b血清型并不一致。表明galE基因在不同血清型LM菌株中对WTAs修饰的影响可能并不相同。本研究结果为深入探索LM致病机制提供重要线索。