硒(Selenium,Se)作为机体必需的微量元素,主要通过结合到硒蛋白中发挥其生物学功能。硒蛋白S(SelS)是硒蛋白家族的重要成员之一,因其在抗氧化、调节内质网应激和维持糖代谢稳态等方面的功能受到广泛关注。SelS是结肠组织中高度表达的硒蛋白之一,在调节炎症反应中发挥着至关重要的作用,但其在溃疡性结肠炎(UC)中的具体作用尚不清楚。UC是炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)的主要类型之一,以复发性肠道炎症为特征,多种动物和人均易发,严重影响健康状态和生活质量,正成为一个主要的全球公共卫生问题。研究表明,巨噬细胞极化是参与UC炎症反应的重要环节,并且氧化应激、肠上皮细胞死亡和屏障功能受损等可以促进UC的发展。体内外研究已经证明,SelS敲低会加重炎症反应。然而SelS调节巨噬细胞极化及其在UC结肠上皮细胞程序性坏死方面的作用仍然是未知的。因此,本课题通过免疫共沉淀联合质谱分析(Co IP-MS)、免疫荧光共定位和蛋白-蛋白分子对接确定SelS和泛素蛋白A52残基核糖体蛋白融合产物1(Uba52)的互作关系。利用GEO数据库挖掘SelS、Uba52和Yes相关蛋白(YAP)与IBD中巨噬细胞等免疫细胞的相关性。在构建3.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导SelS敲除(SelS KO)小鼠UC模型、2mg/kg硒干预野生型小鼠UC模型、白细胞介素-1β(IL-1β)刺激SelS敲低J774.1巨噬细胞模型、以及J774.1巨噬细胞和MCEC结肠上皮细胞共培养模型的基础上,应用H&E染色、透射电镜、酶联免疫吸附法(ELISA)、实时荧光定量PCR(q RT-PCR)、免疫印迹和免疫荧光等技术,观察结肠组织病理形态学变化,评估氧化应激水平,检测巨噬细胞极化、炎性细胞因子、程序性坏死和紧密连接相关标志物的mRNA和蛋白水平,旨在阐明SelS靶向Uba52调控YAP对巨噬细胞极化和结肠上皮细胞损伤的影响,揭示SelS在UC进程中的作用机制。主要研究结果如下:(1)硒蛋白表达检测结果表明,UC小鼠结肠组织中硒蛋白的整体表达水平高于Ctrl小鼠,并且SelS是表达量增加最明显的硒蛋白。临床症状观察结果表明,SelS KO降低UC小鼠的采食量、饮水量和体重,增加粪便性状评分、粪便隐血评分和DAI评分(P<0.05)。组织病理学检测结果表明,UC小鼠结肠组织炎性浸润程度、浸润范围、溃疡、增生、肉芽组织、杯状细胞丢失和腺体萎缩的评分,以及微绒毛、肠上皮细胞和紧密连接损伤的评分均高于Ctrl小鼠(P<0.05)。SelS KO进一步增加UC小鼠上述损伤评分,以上结果表明,SelS KO会加重结肠损伤。(2)Co IP-MS筛选SelS的互作蛋白结果表明,Uba52是SelS的互作蛋白之一;免疫荧光共定位结果显示SelS和Uba52在细胞质中共定位;分子对接结果表明,SelS和Uba52存在相互作用位点;在UC小鼠结肠组织和IL-1β处理的J774.1细胞中,SelS和Uba52的蛋白水平同时增加(P<0.05),且SelS KO的UC小鼠和SelS敲低的J774.1细胞中SelS和Uba52蛋白水平明显降低(P<0.05)。以上结果表明,SelS对Uba52具有靶向调控作用。(3)YAP蛋白表达的检测结果表明,与Ctrl小鼠和J7LY-18801174.1细胞相比,UC小鼠结肠组织和IL-1β处理的J774.1细胞中MST1、LATS1和YAP的mRNA和磷酸化蛋白水平无明显变化,但YAP总蛋白水平明显增加(P<0.05)。表明YAP蛋白表达不受转录水平调控,也不依赖于传统Hippo信号通路上游一系列激酶级联反应的负调控,可能涉及翻译后修饰调节。SelS KO的UC小鼠和SelS敲低的J774.1细胞中YAP蛋白水平增加伴随Uba52蛋白水平降低,且J774.1细胞Uba52敲低下调YAP蛋白泛素化水平,降低YAP蛋白降解速度,增加YAP蛋白稳定性(P<0.05)。以上结果表明,SelS靶向Uba52通过蛋白酶体依赖性方式促进YAP蛋白泛素化降解,降低YAP蛋白稳定性。(4)巨噬细胞极化的检测结果表明,SelS KO增加UC小鼠结肠组织中CD86标记的M1型巨噬细胞数量和标志物(i NOS、TNF-α、IL-6、IL-12和MCP-1)的mRNA水平,同时降低CD163标记的M2型巨噬细胞数量和标志物(CCL24、MRC1、Arg1、IL-4、IL-10和Fizz1)的mRNA水平(P<0.05)。IL-1β处理下,与si NC组相比,si SelS组中M1型J774.1细胞增加,M2型J774.1细胞减少,然而YAP抑制剂Verteporfin(VP)预处理有效逆转J774.1细胞的极化状态(P<0.05)。以上结果表明,SelS KO上调YAP表达促进UC小鼠结肠组织中巨噬细胞向M1型极化。(5)IBD的GEO数据挖掘结果表明,SelS、Uba52和YAP在UC患者中的表达水平高于正常受试者(P<0.05),而在CD患者中与正常受试者无明显差异。Pearson相关性分析显示SelS和Uba52与UC患者和CD患者中多种免疫细胞浸润密切相关,包括M1和M2型巨噬细胞。YAP仅与UC患者中免疫细胞浸润存在相关性,而与CD患者中免疫细胞浸润水平无关。GO富集结果显示,SelS、Uba52、YAP和巨噬细胞极化标志物组成的基因合集主要参与免疫反应的细胞因子产生、炎症反应的调节、细胞对氧化应激的反应、巨噬细胞活化和IκB激购买VX-661酶/NF-κB信号等生物学过程中。KEGG富集分析结果表明,上述基因合集显著富集在IBD、Toll样受体和NOD样受体等信号通路中。(6)氧化应激水平的检测结果表明,SelS KO增加UC小鼠结肠组织中丙二醛(MDA)含量,降低谷胱甘肽(GSH)含量以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)活性(P<0.05)。IL-1β处理下,与J774.1细胞共培养增加MCEC细胞中ROS水平,并降低SOmedium-chain dehydrogenaseD1、SOD2、GST和CAT的mRNA水平(P<0.05)。与SelS敲低J774.1细胞共培养进一步加剧MCEC细胞中上述mRNA的变化(P<0.05),然而VP预处理J774.1细胞和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理MCEC细胞均有效逆转了MCEC细胞抗氧化基因mRNA的变化(P<0.05)。以上结果表明,SelS KO上调YAP表达促进M1型巨噬细胞极化,增加结肠上皮细胞的氧化应激水平。(7)程序性坏死的检测结果表明,SelS KO增加UC小鼠结肠组织中FADD、RIPK1、RIPK3和MLKL的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。IL-1β处理下,与J774.1细胞共培养增加MCEC细胞中程序性坏死细胞数量,并上调FADD、RIPK1、RIPK3和MLKL的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。与SelS敲低J774.1细胞共培养进一步加剧MCEC细胞中程序性坏死细胞数量的增加和上述基因表达的变化(P<0.05),然而VP预处理J774.1细胞和NAC预处理MCEC细胞均有效逆转了MCEC细胞程序性坏死相关基因表达的变化(P<0.05)。以上结果表明,SelS KO上调YAP表达促进M1型巨噬细胞极化,通过增加结肠上皮细胞的氧化应激水平诱导其发生程序性坏死。(8)炎症相关指标的检测结果表明,SelS KO的UC小鼠结肠组织和IL-1β处理下SelS敲低的J774.1细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白表达水平明显增加(P<0.05),NF-κB p65的mRNA水平和p-NF-κB p65的蛋白水平也明显增加(P<0.05)。此外,SelS KO增加UC小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-17的含量,降低IL-10含量(P<0.05),同时增加TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA和蛋白水平,降低IL-10的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。IL-1β处理下,与J774.1细胞共培养增加MCEC细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白水平(P<0.05),同时降低IL-10的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。与SelS敲低J774.1细胞共培养进一步加剧MCEC细胞中炎性细胞因子水平的变化(P<0.05),然而VP预处理J774.1细胞和NAC预处理MCEC细胞均有效逆转了MCEC细胞炎性细胞因子水平的变化(P<0.05)。以上结果表明,SelS KO上调YAP表达促进M1型巨噬细胞极化并激活NF-κB/NLRP3炎性信号通路,通过增加结肠上皮细胞的氧化应激水平诱导炎性因子释放。(9)紧密连接的检测结果表明,SelS KO加重UC小鼠结肠组织紧密连接结构的损伤,并降低Claudin1、Occludin和ZO-1的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。IL-1β处理下,与J774.1细胞共培养下调MCEC细胞中Claudin1、Occludin和ZO-1的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。与SelS敲低J774.1细胞共培养进一步加剧MCEC细胞中上述基因表达的变化(P<0.05),然而VP预处理J774.1细胞和NAC预处理MCEC细胞均有效逆转了MCEC细胞紧密连接相关基因表达的变化(P<0.05)。以上结果表明,SelS KO上调YAP表达促进M1型巨噬细胞极化,通过增加结肠上皮细胞的氧化应激水平破坏其紧密连接结构。(10)不同硒源对UC小鼠结肠组织损伤影响的检测结果表明,补硒增加UC小鼠的采食量、饮水量和体重,降低粪便性状评分、粪便隐血评分和DAI评分(P<0.05);减少UC小鼠结肠组织显微和超微结构的损伤评分(P<0.05);增加结肠组织SelS和Uba52的蛋白水平,降低YAP的蛋白水平(P<0.05);在mRNA水平上,下调M1型巨噬细胞标志物(i NOS、TNF-α、IL-6、IL-12、MCP-1和MIG,上调M2型巨噬细胞标志物(CCL24、MRC1、Arg1、IL-4、IL-10和Fizz1)(P<0.05);减少MDA含量,增加GSH水平以及GPX、CAT、T-SOD和T-AOC活性(P<0.05);下调p-NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的蛋白水平,上调IL-10的蛋白水平(P<0.05);降低FADD、RIPK1、RIPK3和MLKL的蛋白水平(P<0.05);增加Claudin1、Occludin和ZO-1的蛋白水平(P<0.05)。以上结果表明,补硒改善了UC小鼠的结肠损伤,并且不同硒源按作用效果由强到弱依次为纳米硒(Nano-Se)、硒代蛋氨酸(Se Met)、硒化卡拉胶(Se-Car)和亚硒酸钠(Na_2SeO_3)。综上所述,SelS缺失通过靶向下调Uba52抑制YAP蛋白泛素化降解,促进M1型巨噬细胞极化,从而增加结肠上皮细胞氧化应激水平、程序性坏死、炎性因子释放和紧密连接损伤,最终加重UC的结肠损伤。补硒源通过上调SelS表达,抑制M1型巨噬细胞极化介导的结肠上皮细胞程序性坏死,从而改善UC结肠损伤。因此,SelS靶向Uba52调控YAP介导M1极化对UC结肠上皮损伤具有重要影响。本研究结果揭示了SelS新的生物学功能,并提供了SelS调节巨噬细胞极化减轻结肠上皮细胞损伤的证据,为畜禽UC的治疗提供了理论依据,也为比较医学提供借鉴。