研究背景与目的:特应性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是临床常见的一种慢性皮肤疾病,在世界范围内影响多达20%的儿童和5%的成人。特应性皮炎的临床表现主要为皮肤红肿、灼热、渗出甚至糜烂等湿疹样的皮肤损害和慢性瘙痒。特应性皮炎的发病源于多种复杂因素的共同作用,遗传易感性、表皮功能障碍、皮肤微生物组异常、局部神经和免疫系统失调等都在特应性皮炎的发生发展中至关重要。非组胺依赖性痒是指对抗组胺类药物治疗无效的瘙痒,研究表明,其在特应性皮炎引起的严重慢性瘙痒中可能占据着更为主导的地位。目前对于特应性皮炎的治疗手段主要包括局部保湿剂、皮质类固醇、光疗法和免疫疗法等,但这些治疗方法对于中度甚至重度特应性皮炎及其引起的慢性瘙痒症状不能起到很好的疗效,长期服用往往还伴有严重的副作用。因此,对于特应性皮炎,疗效确切、副作用小并且成本低廉的抗炎止痒药物具有很大的研发价值。白鲜皮(Cortex Dictamni)是多年生芸香科植物白鲜的干燥根皮。中医认为,白鲜皮具有清热祛湿、祛风解毒等功效,在数千年来常被用于治疗哮喘、风湿、黄疸等内科疾病以及湿疹、荨麻疹、疥疮等皮肤疾病。生物碱类、柠檬苦素类、香豆素类、黄酮类、甾体类以及多糖等是白鲜皮的主要组成成分。其中,白鲜碱(Dictamnine,Dic)是白鲜皮的主要活性成分之一,也是用于衡量白鲜皮药物质量的指标性成分之一。现代研究发现,白鲜碱具有抗菌、抗过敏、抗癌以及抗炎等多种药理学活性。但关于白鲜皮和白鲜碱对于特应性皮炎及其慢性瘙痒症状的作用及机制尚未被研究,白鲜碱能否作用于非组胺依赖性痒的相关靶点Mas相关的G蛋白偶联受体(Mas-related G protein-coupled receptor,Mrgpr)A3 也未见报道。因此,本论文旨在明确白鲜皮及其主要活性成分-白鲜碱对特应性皮炎及其引起的慢性瘙痒症状的治疗作用,并从动物、分子、细胞等方面深入探究其相关机制,为白鲜皮及白鲜碱在临床皮肤疾病的治疗中提供实验依据。研究内容与方法:本论文的研究内容分为四个部分:第一部分,本论文首先通过数据挖掘技术对近20年内中医治疗湿疹的用药规律进行分析,统计出内服方剂和外用方剂中的高频药物,然后对这些高频药物的性味归经进行分析;接着,我们在高频药物中进行筛选得到核心药物;最后,我们对湿疹临床常见的伴随症状“瘙痒剧烈”的辨证加减用药规律进行分析。第二部分,我们首先通过急性痒行为学实验探究白鲜皮乙醇提取物(Ethanol extract of Cortex Dictamni,ECD)对急性瘙痒的作用。接着,我们通过使用卜氟-2,4-二硝基苯(1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene,DNFB)敏化小鼠建立颈背部特应性皮炎模型,探究白鲜皮乙醇提取物对特应性皮炎引起的慢性瘙痒的作用。然后通过在鼠耳建立特应性皮炎模型探究白鲜皮乙醇提取物对特应性皮炎症状的作用。其次,我们通过分析鼠耳组织切片的苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色和甲苯胺蓝(Toluidine Blue,TB)染色结果,探究白鲜皮乙醇提取物对特应性皮炎小鼠鼠耳表皮和真皮厚度以及嗜酸性粒细胞、肥大细胞浸润程度的影响,并通过流式细胞技术检测白鲜皮乙醇提取物对鼠耳组织内CD4+T细胞和CD8+T细胞数量的影响。通过ELISA技术检测白鲜皮乙醇提取物对特应性皮炎小鼠皮损区域和血清中的炎症细胞因子水平的影响。最后我们通过蛋白免疫印迹实验探究白鲜皮乙醇提取物对特应性皮炎小鼠耳组织内Janus kinase(JAK)-Signal transducer and activator of transcription(STAT)信号通路的影响。第三部分,我们首先通过急性痒行为学实验探究白鲜皮的主要活性成分白鲜碱对氯喹(Chloroquine,CQ,MrgprA3的特异性激动剂)介导的小鼠非组胺依赖性搔痒行为的抑制作用;接着我们利用培养的PirtGCaMP3+/-转基因小鼠的原代神经元细胞进行钙离子成像实验,探讨白鲜碱对MrgprA3+及瞬时受体电位锚定蛋白1(Transientreceptor potential ankyrin 1,TRPA1)+神经元兴奋性的影响,最后我们通过分子对接技术分别分析了白鲜碱与MrgprA3、TRPA1的结合能。第四部分,我们首先在小鼠颈背部建立特应性皮炎模型,探讨白鲜碱对特应性皮炎引起的慢性瘙痒症状以及皮肤损害的作用,并通过组织病理染色和免疫组织化学技术分析白鲜碱对皮损区域的组织病理学改变和免疫细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞)浸润程度的影响。接着,我们利用MrgprA3EGFP-Cre:ROSA26tdTomato+/-转基因Docetaxel使用方法小鼠检测了白鲜碱对MrgprA3+神经纤维和MrgprA3+神经元在特应性皮炎小鼠皮肤及背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)中分布的影响;最后我们利用qRT-PCR、Western Blot手段检测了白鲜碱对特应性皮炎小鼠皮肤及背根神经节中MrgprA3、TRPA1、P2X 嘌呤能离子通道 3 型受体(P2X purinergimmune profileic ion channel type 3 receptor,P2X3R)转录水平和TRPA1、P2X3R的蛋白水平的影响。研究结果:第一部分,我们通过对中文期刊文献数据库中近20年中治疗湿疹相关的医案数据挖掘分析,发现甘草、白鲜皮、生地黄和苦参等在内服方剂中的使用频次最高;苦参、黄柏、地肤子、蛇床子和白鲜皮等在外用方剂中的使用频次最高;通过进一步分析发现,这些高频药物的性味以“苦寒”为主;主归“肝”、“肺”、“脾”经。此外,我们还发现中药白鲜皮在湿疹和瘙痒症的治疗中使用频率较高,且临床疗效显著。这些高频药物对于临床皮肤相关疾病的抗炎止痒用药具有一定的参考价值。第二部分,行为学实验结果表明,给予白鲜皮乙醇提取物对组胺或氯喹诱导的急性瘙痒都有着显著的抑制作用,白鲜皮乙醇提取物治疗也能够明显抑制DNFB引起的特应性皮炎症状和慢性搔痒行为,明确了白鲜皮对特应性皮炎及其引起的慢性瘙痒的治疗作用。同时,对于特应性皮炎小鼠反复抓痒导致的皮肤屏障破坏,表皮层增厚等组织学改变,白鲜皮醇提物治疗能有效地JQ1 IC50缓解小鼠的皮损情况,减轻表皮层增厚。同时,白鲜皮乙醇提取物能够显著下调特应性皮炎小鼠耳组织以及血清中的炎症细胞因子水平并明显降低耳组织内JAK1-STAT3/STAT6信号通路的磷酸化水平。上述结果表明,白鲜皮乙醇提取物对急慢性瘙痒有良好的抑制作用,并能够通过调控JAK1-STAT3/STAT6信号通路发挥抗特应性皮炎作用。第三部分,我们发现给予小鼠白鲜碱(皮肤给药、灌胃给药)治疗能够明显抑制氯喹引起的急性搔痒行为,明确了白鲜碱对非组胺依赖性痒的抑制作用。通过钙成像实验,我们发现白鲜碱不仅对氯喹激活的MrgprA3+神经元或者异硫氰酸烯丙酯(Allyl isothiocyanate,AITC,TRPA1激动剂)激活的TRPA1+神经元兴奋性具有抑制作用,并且能抑制MrgprA3和TRPA1共表达的神经元兴奋性。分子对接实验结果证明,白鲜碱与MrgprA3具有良好的结合亲和力。以上结果提示,白鲜碱能够通过调控MrgprA3-TRPA1通路抑制非组胺依赖性痒觉信号的传导。第四部分,我们进一步发现,在特应性皮炎模型中,白鲜碱能明显抑制DNFB引起的慢性搔痒行为。白鲜碱治疗也能有效地缓解特应性皮炎小鼠反复抓痒导致的皮肤屏障破坏,表皮层增厚等皮损情况。此外,白鲜碱治疗能够显著抑制特应性皮炎小鼠皮肤和背根神经节中MrgprA3+神经纤维和MrgprA3+神经元的分布,并能明显降低特应性皮炎小鼠皮肤和背根神经节中MrgprA3、TRPA1、P2X3R的转录水平和TRPA1、P2X3R蛋白水平。以上结果提示:白鲜碱可能通过调控MrgprA3及其下游离子通道对特应性皮炎引起的慢性瘙痒发挥治疗作用。研究结论:综上所述,我们首先分析了现代中医治疗湿疹的临床用药规律,筛选得到核心药物白鲜皮,然后我们通过体内体外实验证明了白鲜皮乙醇提取物对急慢性瘙痒以及特应性皮炎的炎症症状都具有一定的治疗作用,接着,我们明确了白鲜皮的主要活性物质白鲜碱能够通过调控MrgprA3-TRPA1通路抑制非组胺依赖性痒觉信号传导,对氯喹引起的急性非组胺依赖性瘙痒以及特应性皮炎引起的慢性瘙痒都具有良好的抑制作用。同时,白鲜碱对特应性皮炎的炎症症状也有着明显的改善作用,并显示出一定的体内安全性。本研究探究了白鲜皮和白鲜碱治疗特应性皮炎及慢性瘙痒的作用及相关机制,有助于我们进一步加深对白鲜皮药理作用的认识,为白鲜皮和白鲜碱在临床治疗特应性皮炎和痒相关疾病提供一定的理论基础。同时,本研究也在一定程度上加深了我们对非组胺依赖性痒的认识,为研究和开发治疗非组胺依赖性痒的有效药物提供参考。