大豆7MCC950生产商S球蛋白作为断奶仔猪日粮中的主要过敏原,会引起断奶仔猪过敏性肠炎,导致仔猪消化吸收功能下降甚至腹泻而死亡。白藜芦醇、槲皮素、秦皮甲素均在临床用于治疗炎性相关的肠道疾病,具有良好的抗炎抗氧化效果,能提高肠道免疫力、维护肠道健康。本试验目的在于探究白藜芦醇、槲皮素、秦皮甲素能否用于治疗大豆7S球蛋白引起的断奶仔猪过敏性肠炎,并初步探究其机制,为临床中药单体用于防控大豆蛋白引起的断奶仔猪过敏性肠炎具有重要意义。试验一三种中药单体对大豆7S球蛋白诱导的IPEC-J2细胞炎性损伤的影响(1)通过CCK-8法测定不同浓度的白藜芦醇、槲皮素、秦皮甲素对IPEC-J2细胞存活率的影响,每种中药筛选出三种浓度检测其对5 mg/m L大豆7S球蛋白诱导的IPEC-J2细胞存活率的影响。结果表明,0.156 mg/L、0.313 mg/L、0.625 mg/L白藜芦醇,0.625 mg/L、1.25 mg/L、2.5 mg/L槲皮素,10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L秦皮甲素均能显著提高5 mg/m L大豆7S球蛋白作用下IPEC-J2细胞的存活率,用于后续试验。(2)将不同浓度的上述三种药物分别与5 mg/m L大豆7S球蛋白共同培养IPECJ2细胞24 h后,采用ELISA法检测细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10和i NOS含量,微量法检测细胞因子NO和氧化产物MDA含量以及抗氧化酶GSHelectrodiagnostic medicine和SOD活性。结果表明:5 mg/m L大豆7S球蛋白能显著升高细胞促炎因子和过氧化产物的含量,显著降低抗炎因子的含量和抗氧化酶活性(P<0.01)。与大豆7S球蛋白组相比,不同浓度的上述三种药物均能显著提高细胞存活率,显著降低促炎因子和过氧化产物含量,显著提高抗炎因子的含量和抗氧化酶活性(P<0.01),由此说明5 mg/L大豆7S球蛋白能通过降低细胞活性,调控IPEC-J2细胞炎性因子的分泌、氧化产物的合成以及抗氧化酶活性对IPEC-J2细胞造成炎性损伤,而不同浓度的上述三种药物均能缓解5 mg/m L大豆7S球蛋白诱导的IPEC-J2细胞的炎性损伤,其中0.625 mg/L白藜芦醇、2.5 mg/L槲皮素、20 mg/L秦皮甲素效果最佳。试验二基于NF-κB/MAPK通路探究三种中药单体对大豆7S球蛋白诱导的IPEC-J2细胞凋亡和炎性损伤的影响试验分为对照组,7S模型组(5 mg/m L)和不同药物(0.625 mg/L白藜芦醇、2.5mg/L槲皮素、20 mg/L秦皮甲素)与大豆7S球蛋白共同添加组。(1)探究白藜芦醇、槲皮素和秦皮甲素对大豆7S球蛋白诱导的IPEC-J2细胞凋亡的影响。采用流式细胞术检测细胞ROS水平和细胞凋亡率,采用RT-q PCR检测促凋亡基因Caspase-3和Bax以及抗凋亡基因Bcl-2的表达。结果表明与对照组相比5mg/m L大豆7S球蛋白能够显著提高IPEC-J2细胞凋亡率和细胞内ROS水平,显著促进凋亡基因表达、抑制抗凋亡基因表达(P<0.01)。而添加0.625 mg/L白藜芦醇、2.5 mg/L槲皮素、20 mg/L秦皮甲素后,能显著下调细胞内ROS水平和细胞凋亡率,显著抑制促凋亡基因、促进抗凋亡基因的表达(P<0.01)。(2)探究白藜芦醇、槲皮素和秦皮甲素对大豆7S球蛋白诱导的IPEC-J2细胞NF-κB/MAPK信号通路的调节作用。通过RT-q PCR和Western Blot检测细胞P65NF-κB、P38 MAPK和JNK的m RNA水平和蛋白表达及磷酸化水平。结果表明,5mg/m L大豆7S球蛋白能激活NF-κB/MAPK信号通路,显著上调P65 NF-κB、P38MAPK和JNK的m RNA水平和蛋白表达量及其磷酸化水平(P<0.01)。添加0.625mg/L白藜芦醇、2.5 mg/L槲皮素、20 mg/L秦皮甲素能显下调上述蛋白m RNA水平和蛋白表达量及其磷酸化水平(P<0.01)。因此,5 mg/m L大豆7S球蛋白可能通过激活NF-κB/MAPK信号通路引起IPEC-J2细胞炎性损伤,而0.625 mg/L白藜芦醇、2.5 mg/L槲皮素、20 mg/L秦皮甲素能通过影响NF-κB/MAPK信号通路的激活缓解5mg/m L大豆7S球蛋白引起的IPEC-J2细胞的炎性损伤。结论:5 mg/m L大豆7S球蛋白能通过诱导IPEC-J2细胞氧化应激,激活NF-κB/MAPK信号通路并且调控凋亡基因的表达,引起IPEC-J2细胞炎性损伤和凋亡。0.625 mg/L白藜芦醇、2.5 mg/L槲皮素、20 mg/L秦皮甲素可以通过影响NF-κB/MAPK信号通路的激活显著缓解大豆7S球蛋白引起的细胞炎性损伤和凋亡。这三种中药有望AZD2281 molecular weight用于大豆蛋白日粮引起的断奶仔猪腹泻的防控。