近年来,随着人们生活水平的逐步提高,糖尿病患病率也逐年攀升,其已成为人类最常见的慢性非传染性疾病之一。尽管盐酸二甲双胍等药物能够有效地降低部分II型糖尿病(T2DM)患者血糖水平,但长期服用后,可能会引起肝损伤以及胃肠道不良反应,因此,在安全有效的天然活性物质基础上开发副作用低,且对T2DM高血糖症状具有多个作用途径的植物降糖剂成为本领域的研究热点。本研究从白背三七植物中提取出一种粗多糖,对其进行分离纯化、化学组成分析及结构表征,揭示其初级结构;通过体外实验研究白背三七多糖化学抗氧化活性以及利用细胞模型探究其体外降血糖活性,并通过动物实验进一步研究白背三七多糖的体内降血糖活性;通过分析肠道菌群微生态变化等进行系统的关联性研究,揭示其血糖调节作用的机制,为白背三七多糖相关的功能性食品和药物的开发提供理论依据。主要研究结果归纳如下:1、研究表明传统的热水提取法提取的白背三七多糖(GDP)得率仅为6.85%,因此采用超声辅助提取法对GDP进行提取。通过单因素试验、Box-Behnken试验以及响应面优化等数理统计方法,确定了白背三七多糖提取优化工艺为:超声功率270 W、提取温度60℃、提取时间37 min。在此条件下,GDP提取率为9.18%,比热水提取法的提取率(6.85%)提高了34.01%。使用纤维素DE-52和葡聚糖G-100层析柱对GDP进行分离纯化,得到中性多糖组分GDP0和酸性多糖组分GDP3、GDP5,得率分别为18.8%、41.1%和6.9%。2、化学组成分析显示GDP和GDP3总糖含量较高,均在60%以上,各组分几乎不含有蛋白质和多酚,各组分中GDP的糖醛酸含量和硫酸根含量最高,纯化组分中,GDP3含有更高的糖醛酸,GDP5含有更高的硫酸根。GDP、GDP0、GDP3和GDP5的主要分子量(Mw)分别为1634.7 k Da、1.7 k Da、651.2 k Da和1521.6 k Da。单糖组成及NMR分析显示,GDP0主要的链接方式可能是→3)-β-Glcp-(1→,→4,6)-α-Glcp-(1→,α-Galp-(1→,→2,4)-α-Rhap-(1→,→2,3)-α-Fucp-(1→;GDP3的主要链接方式可能是6)-β-Galp-(1→。各组分的紫外吸收光谱显示,在260 nm、280selleck Torin 1 nm及>400 nm处几乎没有明显的吸收峰,说明GDP、GDP0、GDP3和GDP5的蛋白质、核酸和色素含量低。红外光谱分析显示GDP各组分含有α和β型糖苷键。X射线衍射分析结果显示白背三七多糖各组分倾向于半晶体状态。刚果红实验结果表明GDP、GDP3和GDP5具有三螺旋结构。DSC和TGA分析表明白背三七多糖各组分均具有较好的热稳定性。流变学实验显示,GDP及各组分有较好的流变特性。GDP还具有优异的乳化特性,能够在添加量为2%时稳定油相比为70%的乳液,且乳液稳定性良好。3、体外化学抗氧化实验表明,各组分具有良好的清除DPPH、羟基自由基和ABTS的能力及还原力,总体表现GDP活性最好,清除DPPH、羟基自由基和ABTS的IC_(50)值分别是0.107 mg/m L、0.252 mg/m L和0.589 mg/m L,明显优于其他组分(P<0.05)。GDP及各纯化组分对H_2O_2诱导的氧化应激巨噬细胞RAW 264.7有较好的保护作用,能够显著降低氧化应激细胞中ROS水平、提高SOD酶和CAT酶活力、降低MDA含量。在100μg/m L的实验浓度下,细胞抗氧化能力均表现为GDP>GDP3>GDP5>GDP0。抗氧化作用机制研究表明,GDP和GDP3能够显著提高SOD1、CAT m RNA的表达水平,还能通过上调细胞中Nrf-2和HO-1的m RNA表达影响Nrf-2信号通路。因此,通过上调抗氧化酶及Nrf-2信号通路中相关基因的表达可能是GDP重要的抗氧化作用机制。4、体外降血糖活性测试结果显示GDP、GDP3和GDP5均能有效抑制α-葡萄糖苷酶,且抑制动力学和荧光实验显示三个组分对酶的抑制均为混合型抑制,能够通过改变酶的三级结构达到抑制酶活的效果。细胞实验证明GDP、GDP3和GDP5可以提高胰岛素抵抗(IR)-Hep G2细胞的葡萄糖吸收能力,提升细胞内肝糖原含量以及丙酮酸激酶(PK)与己糖激酶(HK)的活性。通过检测多糖对IR-Hep G2细胞血糖调节相关基因的表达,发现GDP各组分能够通过上调PI3K、GLUT4和AMPK,下调G6pase和PEPCK m RNA的表达,降低细胞胰岛素抵抗,改善细胞葡萄糖利用度。5、动物实验表明,连续灌胃4周的800 mg kg~(-1) BW的剂量(高剂量)的白背三七多糖GDP,能够明显改善链脲佐菌素(STZ)诱导的T2DM小鼠的高血糖症状。具体表现为:高剂量GDP能够显著提升T2DM小鼠的体重,显著降低空腹血糖、口服葡萄糖耐量和糖化血清蛋白含量。有效恢复血清胰岛素水平,改善胰腺组织病变,恢复胰岛细胞数量和形态,显著提升血清中溶血素水平,有效降低血清和肝脏中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及低密度脂蛋白(LDL-C)水平,恢复高密度脂蛋白(HDS-3201 IC50DL-C)水平,有效降低血清中IL-6和TNF-α细胞因子含量,提高肝脏中糖原含量、SOD酶、谷胱甘肽过氧化物酶和CAT酶的活力,明显降低肝脏中MDA含量以及脏器指数。显著上调T2DM小鼠肝脏中GLUT4、Ins R、IRS2和GS的基因相对表达量,下调G6Pase、PEPCK以及GSK-3β的基因相对表达水平。推测GDP是通过影响PI3K/Akt通路中相关基因表达,来降低小鼠胰岛素抵抗,实现对小鼠血糖的调节和稳定。6、小鼠肠道菌群结构分析结果显示,在门水平上,相比于正常组,模型组高血糖小鼠肠道中厚壁菌门显著增加,而拟杆菌门显著下降。经GDP介入后,糖尿病小鼠的肠道微生物中厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度比值F:B明显下降。在属层面上,经过不同剂量GDP干预后,norank＿f＿＿Muribaculaceae、Alistipes、Prevotellaceae＿UCG-001和Bifidobacterium等显著升高,unclassified＿f＿＿Lachnospiraceae等丰度显著降低,GDP的治疗组中Muribaculum、Bifidobacteriaceae、Deferribacteres是显著差异物种,可能在调节菌群恢复和维持肠道微生态环境中发挥重要的作用。关联短链脂肪酸(SCFAs)环境因子分析发现,Turicibacter、Prevotellaceae＿UCG-001、Bifidobacterium等与肠道乙酸、丁酸和戊酸等短链脂肪酸成呈正相关。关联糖化血清蛋白和胰岛素环境因子分析发现,Monoglobus、g＿＿unclassified＿f＿＿Oscillospiraceae等呈现正相关,Lactobacillus、Bacteroides、Prbiofuel cellevotellaceae＿UCG-001等呈现负相关。关联血清相关生化指标环境因子分析发现,Bacteroides、Helicobacter与HDL-C呈现正相关,与TG、TC、LDL-C呈现负相关;Monoglobus、g＿＿unclassified＿f＿＿Oscillospiraceae与TG、TC、LDL-C呈现正相关,HDL-C呈现负相关。关联血清内炎症因子环境因子分析发现,Weissella、Monoglobus、Odoribacter等呈现正相关,Dubosiella、Bacteroides等呈现负相关。预测功能关联分析发现,GDP有显著提升细胞运动、信号转导机制、转录和碳水化合物运输和代谢,以上功能与机体血糖调节密切相关,揭示了白背三七多糖通过调控肠道菌群对T2DM小鼠血糖调节的可能作用机制。