目的:糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最常见的慢性微血管并发症之一,其发病机制尚未完全阐明,与不合并DKD的DM患者相比,DKD患者死亡率更高。DKD的发生发展是多因素共同作用的结果,其中肾脏纤维化是其重要的发病机制之一。纤维连接蛋白(fibronectin,FN)是细胞外基质的主要成分,转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)也已经被证明是纤维化的生物标志物,参与了肾脏纤维化的过程。甲基转移酶14(methyltransferase-like 14,METTL14)是催化N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)的一种重要甲基转移酶,m6A已被证实在许多生物发育、代谢和繁殖中发挥重要作用。近年来,m6A甲基化修饰逐渐成为DM和DKD的研究热点,有报道提示m6A的含量与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)风险呈负相关,但其与DKD之间的关系有待更系统、更深入的研究。鉴于有关METTL14在大鼠肾小球系膜细胞(rat mesangial cells,RMCs)中的研究鲜有报道,因此我们将重点关注RMCs中METTL14的调控。叉头框转录因子O1(forkhead box O1,FoxO1)是包含叉头盒的转录因子O家族的成员,通过调控下游靶基因的表达参与细胞增殖、凋亡、代谢调节等。有报道提示FoxOs通过影响系膜增生、细胞外基质堆积、调节纤维化因子的表达,参与调控DKD的进程。我们课题组研究结果证明:FoxO1在DKD的进展中呈增长性趋势,并与尿白蛋白与尿肌酐比值(urinary albumin to creatinine ratio,UACR)正相关,提示其可能在DKD的肾脏炎症及纤维化进程中发挥着作用。有文献报道称在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)刺激的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中,METTL14与FoxO1mRNA之间的联系增加,通过si RNA转染下调METTL14后,在mRNA和蛋白水平上部分减弱了TNFα带来的FoxO1增加。但在RMCs中,METTL14、FoxO1两者的相互关系有待进一步探讨。本研究旨在探讨METTL14和FoxO1在DKD发病机制中的相关关系以及在致DKD炎Dolutegravir核磁症反应、纤维化中的分子机制。研究方法:1、使用高糖高脂饮食和低剂量链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导DKD大鼠模型:随机选取6只Sprague Dawley(SD)大鼠喂食高糖高脂饲料,8周后腹腔注射小剂量STZ(30mg/kg),72h后空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)大于16.7mmol/L,为DM造模成功;继续给予高糖高脂饲料喂养至第24周,24h尿蛋白定量大于30mg,为DKD模型建造成功。其余6只大鼠为对照组,并在整个实验阶段始终喂食普通对照饲料。2、用血糖仪和体重秤动态监测大鼠血糖水平和体重变化。酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)用以24h尿蛋白定量。收集双肾组织,部分用于实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot,WB)来检测METTL14、p FoxO1、FoxO1、FN、TNFα、TGFβ1的表达;提取大鼠肾脏组织RNA用m6A定量试剂盒检测总mRNA的m6A甲基化修饰水平;其余肾组织用于肾脏组织学染色分析以检查DKD病理改变。3、体外培养RMCs,将其分为正常糖对照组(normal glucose control group,NG,5.5 mmol/L的葡萄糖)、甘露醇对照组(high mannitol group,HM,5.5 mmol/L的葡萄糖+24.5 mmol/L的甘露醇)以及高糖组(high glucose group,HG,30 mmol/L的Laparoscopic donor right hemihepatectomy葡萄糖)。分别在高糖处理24h、48h、72h后收集细胞,用WB检测METTL14的表达,以选择最佳培养时间点,后续实验的HG组按照此时间标准收集细胞。4、确定最佳高糖处理时间后,用q RT-PCR检测NG组、HM组和HG组RMCs中METTL14和FoxO1 mRNA的表达。WB检测METTL14、p FoxO1、FoxO1、FN、TNFα、TGFβ1的蛋白表达。使用m6A定量试剂盒检测RMCs总mRNA的m6A甲基化修饰水平。5、在体外高糖培养的RMCs中转染METTL14过表达质粒,将其分为HG组、HG+METTL14(+)-NC组、HG+METTL14(+)组。用荧光显微镜和WB观察转染效率。成功构建RMCs转染METTL14过表达质粒模型后,收SAG临床试验集细胞的RNA和蛋白,用m6A定量试剂盒检测各组RMCs中总mRNA m6A甲基化水平;用WB检测p FoxO1、FoxO1及炎症纤维化相关蛋白FN、TNFα、TGFβ1的表达。结果:1、大鼠一般情况:成功构建DKD大鼠模型后,DKD组大鼠出现多饮,多食,多尿,精神萎靡,活动量减少,嗜睡等症状,且体重较NC组大鼠下降明显。DKD组大鼠的24h尿蛋白、FBG显著高于NC组。2、DKD组大鼠肾脏组织标本呈不均匀增大,肾脏组织染色分析后显示肾脏结构破坏,肾小球肿大,系膜细胞异常增生,且糖原染色和胶原纤维染色加深。3、相较于NC组,DKD组大鼠肾脏中METTL14表达降低,大鼠肾脏组织总mRNA的m6A修饰水平下降。p FoxO1/FoxO1、FN、TNFα、TGFβ1的表达增加。差异有统计学意义。4、在体外高糖培养的RMCs中发现METTL14表达降低,p FoxO1/FoxO1表达增高,炎症纤维化相关蛋白FN、TNFα、TGFβ1的表达增多。高糖组RMCs中总mRNA的m6A修饰水平显著低于对照组。5、在体外高糖培养的RMCs过表达METTL14后,上调了RMCs中总mRNA的m6A甲基化修饰水平。6、在体外高糖培养的RMCs过表达METTL14后,下调了高糖诱导的FN、TNFα、TGFβ1和p FoxO1/FoxO1的高表达。结论:1、DKD组大鼠肾脏组织和体外高糖培养的RMCs中,METTL14水平降低,高糖培养的RMCs总mRNA的m6A修饰水平下调;p FoxO1/FoxO1水平升高,同时FN、TNFα和TGFβ1这些纤维化指标的表达水平显著高于对照组。2、过表达METTL14后,RMCs中总mRNA的m6A修饰水平上调,减少了RMCs因高糖刺激升高的FN、TNFα、TGFβ1和p FoxO1/FoxO1的蛋白表达水平。提示甲基转移酶METTL14可以上调RMCs总mRNA的m6A甲基化水平从而抑制FoxO1表达,进而抑制DKD的肾脏炎症及纤维化进程,表明METTL14可能成为DKD治疗的新靶点。