结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)是一种十字花科芸薹属的二年生草本蔬菜作物,在我国蔬菜供应结构中占据重要地位。甘蓝的生产栽培常受到多种病害的威胁,其中菌核病是威胁最大且防治最为困难的病害之一。菌核病的死体营养型真菌病原体导致甘蓝一旦感染菌核病就难以挽回,并且菌核病会向四周持续蔓延,最终导致产量减少甚至绝收。而甘蓝栽培地一旦发生菌核病,其菌核会长期留存于土壤并且无法彻底清除,所以以往的防治方法难有效果。近年来,通过植物感病基因功能丧失得到相应抗性的可行性不断被证实,ANGUSTIFOLIA(AN)基因被证明能够通过调节拟南芥PTI和JA信号通路负调控对菌核病的抗性。在甘蓝与菌核病相互作用的研究中,负调节甘蓝对菌核病抗性的基因很少被报道。本实验对甘蓝的AN基因在抗菌核病中的相关功能做了初步的探究分析,以期为甘蓝抗病育种提供新的思路。试验结果如下:1、甘蓝AN基因在抗感材料中的表达量变化分析。前期,本实验室已将野生甘蓝的抗菌核病QTLs聚合到生产性状良好的感病品种B2Q中,对所有自交后代进行菌核病抗性鉴定后发现107-14-10和107-14-12相比其它自交后代表现出较强的抗性此网站。所以继续对107-14-10、107-14-12和B2Q接种核盘菌并在接种后0到96小时每隔12小时取样,以此分析AN基因在抗感材料接种核盘菌后不同时期的表达量变化。荧光定量PCR结果显示,抗感材料分别接种核盘菌后感病材料B2Q中AN基因的表达量水平总体高于抗病材料,且在12～24小时之间最为显著,而48小时后甘蓝抗感材料中的AN基因表达量水平无显著差异,说明AN基因可能与甘蓝对菌核病的抗性有关。2、在烟草中超表达AN基因并分析对菌核病抗性的影响。为了更清楚地探究AN基因在甘蓝对菌核病抗性中的影响,本次试验利用组成型启动子D35s构建了AN基因的超表达载体。通过农杆菌介导的遗传转化将AN基因超表达载体转入烟草。对成功超表达AN基因的烟草转基因植株recent infectionANOE做核盘菌处理后,发现ANOE相较野生型烟草具有更强的菌核病易感性,且部分抗性反应降低。这些结果表明,AN基因可能作为负调节因子参与烟草对菌核病的抗性。3、甘蓝an基因缺失突变体对菌核病抗性的分析。为了进一步验证甘蓝AN基因是否参与多种菌核病抗性相关反应的调节,本试验构建了靶向甘蓝AN基因的CRISPR/Cas9系统。在实验室已有的p CAMBIA1300-AFCas9载体中添加抗除草剂基因Bar和紫色花青素基因MYB作为筛选基因和转基因可视化元件,并将Bar MYB蛋白与Cas9蛋白融合表达以提高Cas9蛋白的表达水平,得到了p CAMBIA1300-35s-Bar MYB-AFCas9载体。为了提高敲除的成功率,本试验设计了四个靶向AN基因CDS区的位点,用GG法组装四个靶位点构成的t RNA表达盒后将该表达盒装载到敲除载体中得到了最终的p CAMBIA1300-35s-Bar MYB-AFCas9-AN-t RNA载体。最终载体经农杆菌介导的遗传转化成功转入甘蓝B2Q并获得了多个突变类型不同的甘蓝AN基因缺失突变体an-t。对部分生长状况良好的an-t甘蓝接种核盘菌后发现该突变体在感病前期确实能够提高对菌核病的抗性,并在接种后24～48小时最为明显,而感病后期与未转化植物无显著差异。进一步分析AN基因突变体和未转化植株接种核盘菌后的ROS爆发、胼胝质沉积以及与抗病通路相关的部分基因后发现,an-t甘蓝相较未转化的甘蓝B2Q产生了更强烈的ROS爆发和更多的胼胝质沉积KPT-330 MW,并且与抗病通路相关的MPK3、MPK6、PDF1.2基因的表达均显著上调。这些结果表明甘蓝AN基因对核盘菌抗性的负调控作用可能与广泛的PTI反应相关。