目的:1.复制衰竭心肌细胞模型。2.探索乌头碱对模型细胞的毒性作用与氧化应激、线粒体能量代谢障碍及钙超载的相关性。3.研究甘草次酸拮抗乌头碱对模型细胞毒性作用与缓解氧化应激、调节线粒体能量代谢及维持钙稳态的关联。4.验证甘草次酸是否通过AMPK、Ca MKⅡ通路拮抗乌头碱对模型细胞的毒性作用。方法:1.复制衰竭H9c2心肌细胞模型:采用不同浓度的戊巴比妥钠、过氧化氢、阿霉素分别处理H9c2心肌细胞后,通过CCK-8法,测定H9c2心肌细胞存活率。2.确定乌头碱、甘草次酸在模型细胞的给药浓度:将H9c2心肌细胞分空白对照组、模型组、乌头碱组(15、30、60、120、240、360、480、720μmol/L)、甘草次酸组(15、30、60、120、240μmol/L),除空白对照组,各组首先用100μL的2μmol/L阿霉素处理24 h以复制衰竭H9c2心肌细胞模型,各药物组分组给予100μL相应浓度的药物处理24 h后,采用CCK-8法,检测各组衰竭H9c2心肌细胞存活率。3.乌头碱配伍甘草次酸前后对模型细胞氧化应激反应、线粒体及钙离子的影响:将H9c2心肌细胞分为15组,即空白组,模型组,30μmol/L甘草次酸组,15、30、60、120、240、480μmol/L乌头碱组,及30μmol/L甘草次酸分别配伍15、30、60、120、240、480μmol/L乌头碱组。上述细胞除空白组外,均先用2μmol/L阿霉素处理24 h造模,各药物组模型细胞加1 m L相应浓度的药物孵育24 h。显微观察细胞形态、线粒体微观结构,CCK-8法测定细胞存活率,酶联免疫法检测乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、ATP酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP),荧光探针法测定活性氧(specialized lipid mediatorsreactive oxygen species,ROS)、膜电位、线粒体内外Ca~(2+)浓度。4.测定乌头碱配伍甘草次酸前后模型细胞AMPK、PGC-1α,Ca MKⅡ、SERCA2a、Ry R2蛋白的表达:1)将H9c2心肌细胞为7组,即空白对照组、模型组、AMPK抑制剂(Compound c)组、甘草次酸组(30μmol/L)、乌头碱组(480μmol/L)、甘草次酸配伍乌头碱组、Compound c与甘草次酸乌头碱FUT-175共同干预组LGK-974纯度。各组细胞处理流程如下:除空白对照组外,其余各组均先用2μmol/L阿霉素处理24 h造模,Compound c组及Compound c与甘草次酸乌头碱共同干预组再给予5μmol/L Compound c处理2 h;甘草次酸组(30μmol/L)、乌头碱组(480μmol/L)、甘草次酸配伍乌头碱组、Compound c与甘草次酸乌头碱共同干预组分别给予1 m L相应浓度的药物处理24 h后,采用蛋白免疫印迹法,检测各组AMPK、PGC-1α蛋白表达。2)将H9c2心肌细胞分为7组,即空白对照组、模型组、Ca MKⅡ抑制剂(KN-93)组、甘草次酸组(30μmol/L)、乌头碱组(480μmol/L)、甘草次酸配伍乌头碱组、KN-93与甘草次酸乌头碱共同干预组。各组细胞处理程序如下:除空白对照组外,其余各组先用2μmol/L阿霉素处理24 h造模,KN-93组、KN-93与甘草次酸乌头碱共同干预组再给予5μmol/L KN-93处理2 h;甘草次酸组(30μmol/L)、乌头碱组(480μmol/L)、甘草次酸配伍乌头碱组、KN-93与甘草次酸乌头碱共同干预组分别给予1 m L相应浓度的药物处理24h后,以蛋白免疫印迹法检测各组Ca MKⅡ、SERCA2a、Ry R2蛋白表达水平。结果:1.阿霉素、戊巴比妥钠、过氧化氢均可降低H9c2心肌细胞存活率:CCK-8法检测发现,H9c2心肌细胞经2μmol/L阿霉素、0.8%戊巴比妥钠及400μmol/L过氧化氢处理后细胞存活率均约为50%,且与空白组比较具有极显著差异(P<0.01)。2.乌头碱在模型细胞的梯度给药浓度为15、30、60、120、240、480μmol/L,甘草次酸在模型细胞的给药浓度为30μmol/L:通过CCK-8法检测15、30、60、120、240、360、480、720μmol/L乌头碱组及15、30、60、120、240μmol/L甘草次酸组衰竭H9c2心肌细胞的存活率变化,实验结果显示,15、30、60μmol/L乌头碱组细胞存活率与模型组比较,呈现下降趋势,无显著差异,120、240、360、480、720μmol/L乌头碱的细胞存活率与模型组具有显著差异(P<0.01或P<0.05),但720μmol/L乌头碱的细胞存活率过低,依照药理学实验给药浓度等比递增梯度法乌头碱给药浓度梯度设置为15、30、60、120、240、480μmol/L。15、30、60μmol/L甘草次酸的细胞存活率与模型组比较,均无显著差异,30μmol/L甘草次酸的细胞存活率与2μmol/L阿霉素的细胞存活率最接近,甘草次酸给药浓度设置为30μmol/L。3.乌头碱配伍甘草次酸后保护衰竭心肌细胞线粒体结构,提高线粒体膜电位、SOD、CAT、GSH、ATP含量、ATP转运酶活性,降低MDA、ROS及线粒体内外Ca~(2+)浓度:实验表明,与模型组比较,乌头碱破坏衰竭H9c2心肌细胞的线粒体结构,且不同浓度乌头碱均可降低模型细胞内SOD、CAT、GSH、ATP含量、线粒体膜电位、抑制心肌细胞内ATP相关转运酶活性、增加衰竭心肌细胞内MDA、ROS含量、提高细胞及线粒体内Ca~(2+)浓度(P<0.01或P<0.05),以上作用均呈剂量依赖(R~2=0.5445～0.9794)。与单用乌头碱比较,乌头碱配伍甘草次酸后,保护线粒体结构的同时,衰竭心肌细胞内SOD、CAT、GSH、ATP含量、线粒体膜电位、ATP相关转运酶活性等均增加,细胞内MDA、ROS含量、细胞及线粒体内Ca~(2+)浓度均降低(P<0.01或P<0.05)。4.乌头碱配伍甘草次酸影响模型细胞AMPK、PGC-1α,及Ca MKⅡ、SERCA2a、Ry R2的蛋白表达:研究显示,与模型组相比,乌头碱降低模型细胞的AMPK、PGC-1α、SERCA2a蛋白表达,升高Ca MKⅡ、Ry R2蛋白表达(P<0.01或P<0.05);与乌头碱单用组相比,乌头碱配伍甘草次酸组使模型细胞的AMPK、PGC-1α、SERCA2a蛋白表达升高,Ca MKⅡ、Ry R2蛋白表达降低(P<0.01或P<0.05)。结论:1.0.8%戊巴比妥钠及400μmol/L过氧化氢、2μmol/L阿霉素均能成功复制衰竭心肌细胞模型。前期预实验发现,0.8%戊巴比妥钠和400μmol/L过氧化氢诱导的衰竭细胞经乌头碱处理后,其细胞存活率过低,无法开展后续研究。故,本文以2μmol/L阿霉素复制衰竭心肌细胞模型。2.氧化应激、线粒体能量代谢障碍及钙超载是乌头碱损伤模型细胞的主要作用环节。3.甘草次酸通过缓解氧化应激、调节线粒体能量代谢及恢复钙稳态拮抗乌头碱对模型细胞的毒性作用。4.甘草次酸拮抗乌头碱对模型细胞的毒性作用机制可能与调节AMPK、PGC-1α,Ca MKⅡ、SERCA2a、Ry R2蛋白有关。