荧光素酶在科学研究中具有广泛的应用,其中作为报告基因研究最多,大多在细胞内发生,还可以应用于ATP检测、焦磷酸测序等。许多突变北美萤火虫荧光素酶已经被开发出来产生不同的生物发光颜色、提高酶稳定性或催化效率,然而,这些并没有实现发光强度及热稳定性的显著提高。本课题主要通过理性设计的方法对北美萤火虫荧光素酶进行分子改造,以获得在酶活性较原始酶活性不下降的前提下,酶热稳定性显著提高的突变体,并将其应用于药物筛选。本课题基于共识序列查找和表面氨基酸替换的理性设计方法,构建了35个单位点突变体,进行实验验证发现了6个与野生型相比热稳定性和酶活性提高的单位点突变体,分别为T214N、S201T、L530I、A532R、T290P、K28R,其中对应突变体在35℃金属浴10min后的热稳定性与野生型相比均分别提高了20.31、0.72、1.82、1.16、4.75、0.83倍。室温下测Ceralasertib作用定了对应突变体的酶活,酶的活性相比野生型分别提高了4.5、1.3、1.3、1.0、0.7、0.3倍。对它们进行迭代组合突变,获得了27个多位点组合突变体荧光素酶,测定其在35℃金属浴不同时间(5-25 min)后的Single Cell Analysis残余活性,结果发现金属浴5 min后,野生型荧光素酶的残余活性不到5%,而L530I/T214N/T290P、S201T/L530I/T214N/T290P、A532R/T214N/T290P、T214N/T290P组合突变体在金属浴5 min后残余活性仍然比较高,分别为82%、80%、57%、47%。然后将得到的最优突变体L530I/T214N/T290P应用于药物筛选细胞系构建中,结果显示,L530I/T214N/T290P突变体在selleck FG-4592药物筛选中具有更高的灵敏度,相比野生酶,其测定药物IL-6的IC50值从1.309变为1.034,证实了优化荧光素酶突变体酶活性的提高。